DNA甲基化抑制劑5-Aza-2’-Deoxycytidine(5-Aza-dC)是第一個被美國FDA批準(zhǔn),用于治療人類急性粒細(xì)胞白血病的表觀修飾藥物之一,它能與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT競爭性結(jié)合抑制其活性,阻斷抑癌基因DNA甲基化反應(yīng),是廣譜抗腫瘤藥物。最新研究表明,在結(jié)腸癌和卵巢癌中,5-Aza-dC可激活內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(ERV)來誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素反應(yīng),進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)誘發(fā)的慢性傳染性腫瘤病,對家禽業(yè)危害巨大。禽白血病的防治,一直是困擾家禽業(yè)的世界性難題。本研究發(fā)現(xiàn),DNA甲基化抑制劑5-Aza-dC同樣具有激活內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)而抑制禽白血病病毒ALVJ的功能。由于ERV大多因為突變、缺失而失去編碼蛋白的能力,是體內(nèi)重要的長非編碼RNA來源。那么,5-Aza-dC是否通過誘導(dǎo)ERV產(chǎn)生的長非編碼RNA來發(fā)揮抗腫瘤抗病毒的功能呢?基于以上科學(xué)問題,主要研究內(nèi)容如下:(1)DNA甲基化抑制劑5-Aza-dC具有抑制禽白血病病毒ALVJ的功能。本研究先用禽白血病病毒ALVJ感染雞胚成纖維細(xì)胞CEF 24 h,再通過5 μM 5-Aza-dC處理感染...

【文章頁數(shù)】：118 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
符號說明
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒研究進(jìn)展
        1.1 內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒概述
        1.2 內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒作用機(jī)制
        1.3 內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的天然免疫功能
    2 長鏈非編碼RNA研究進(jìn)展
        2.1 長鏈非編碼RNA概述
        2.2 長鏈非編碼RNA作用機(jī)制
        2.3 長鏈非編碼RNA的天然免疫功能
    3 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑研究進(jìn)展
        3.1 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑概述
        3.2 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑對基因表達(dá)的影響
    4 研究目的和意義
第二章 DNA甲基化抑制劑5-Aza-dC激活雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒并抑制ALVJ感染
    1 前言
    2 材料
        2.1 細(xì)胞與病毒
        2.2 主要試劑
        2.3 主要儀器
    3 方法
        3.1 雞胚成纖維細(xì)胞的制備
        3.2 5-Aza-dC處理雞胚成纖維細(xì)胞
        3.3 共聚焦間接免疫熒光試驗
        3.4 總蛋白提取
        3.5 Western blot
        3.6 總RNA提取
        3.7 轉(zhuǎn)錄組測序
        3.8 cDNA合成和qRT-PCR
    4 結(jié)果與分析
        4.1 5-Aza-dC處理雞胚成纖維細(xì)胞濃度篩選
        4.2 5-Aza-dC抑制J亞群禽白血病病毒增殖和入侵
        4.3 RNA-Seq測序數(shù)據(jù)與質(zhì)量評估
        4.4 RNA-Seq結(jié)果驗證
        4.5 去甲基化試劑5-Aza-dC激活天然免疫相關(guān)基因表達(dá)
        4.6 去甲基化試劑5-Aza-dC激活雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)
    5 討論
第三章 源于雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1的lnc-ALVE1-AS1的鑒定
    1 前言
    2 材料
        2.1 細(xì)胞與載體
        2.2 主要試劑
        2.3 主要儀器
    3 方法
        3.1 總RNA提取及純化
        3.2 RACE快速擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄子兩端序列
        3.3 Northerblot試驗
        3.4 生物信息學(xué)分析
        3.5 RNA FISH試驗
        3.6 轉(zhuǎn)錄子編碼蛋白能力驗證
        3.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.8 Westernbolt
    4 結(jié)果與分析
        4.1 5'RACE和3'RACE鑒定轉(zhuǎn)錄子全長
        4.2 Northern blot鑒定轉(zhuǎn)錄子
        4.3 生物信息學(xué)預(yù)測轉(zhuǎn)錄子編碼能力和二級結(jié)構(gòu)
        4.4 體外實驗驗證轉(zhuǎn)錄子編碼能力
        4.5 RNA FISH鑒定lnc-ALVE1-AS1亞細(xì)胞定位
    5 討論
第四章 長鏈非編碼RNA lnc-ALVE1-AS1的天然免疫功能及分子機(jī)制
    1 前言
    2 材料
        2.1 細(xì)胞、載體與病毒
        2.2 主要試劑
        2.3 主要儀器
    3 方法
        3.1 lnc-ALVE1-AS1過表達(dá)載體構(gòu)建
        3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.3 qRT-PCR
        3.4 lnc-ALVE1-AS1 RNAi干擾試驗
        3.5 ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)
        3.6 共聚焦免疫熒光
        3.7 RNA Pulldown
        3.8 WesternBlot
        3.9 RNA FISH
        3.10 TLR3干擾試驗
        3.11 TLR3信號抑制試驗
    4 結(jié)果與分析
        4.1 lnc-ALVE1-AS1過表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2 lnc-ALVE1-AS1激活I(lǐng)型干擾素信號轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)
        4.3 干擾lnc-ALVE1-AS1抑制干擾素刺激基因表達(dá)
        4.4 lnc-ALVE1-AS1抑制禽白血病病毒ALVJ增殖
        4.5 lnc-ALVE1-AS1影響胞內(nèi)核酸識別因子的表達(dá)水平
        4.6 TLR3是lnc-ALVE1-AS1發(fā)揮天然免疫抗病毒反應(yīng)的核酸識別因子
    5 討論
全文結(jié)論
主要創(chuàng)新點
進(jìn)一步研究展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
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