果膠桿菌屬(Pactobbbacterium)細(xì)菌寄主范圍廣泛,在寄主植物上造成枯萎、腐爛及黑脛癥狀,是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中十大植物病原細(xì)菌之一。果膠桿菌可以外泌一系列植物細(xì)胞壁降解酶類(PCWDEs),這些酶類是其重要的致病因子。其中,胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種(P.carotovorum subsp.carotovorum)的寄主范圍最為廣泛,可以侵染200多種植物,包括具有重要經(jīng)濟(jì)價值的蔬菜及花卉,例如馬鈴薯、白菜等。隨著中國馬鈴薯主糧化的推進(jìn),對此類可造成馬鈴薯嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的植物病原細(xì)菌的致病機(jī)理研究具有非常重要的意義。Hfq作為一類全局調(diào)控蛋白,廣泛存在于革蘭氏陰性及陽性細(xì)菌中。在動物致病菌中大量研究表明,其參與調(diào)控了多個細(xì)胞過程及代謝途徑,對大多數(shù)細(xì)菌的致病能力均有影響,但是有關(guān)Hfq蛋白在植物致病菌中的研究較少。為了探究Hfq在P.carotovorum subsp.carotovorum PccS 1中的致病相關(guān)功能,本研究通過同源重組的方法構(gòu)建了 Hfq缺失突變體,致病性測定結(jié)果表明Δhfq的致病能力幾乎完全喪失,生物學(xué)表型分析結(jié)果顯示物缺失突變株的胞外酶分泌顯著減少,與此同...

【文章頁數(shù)】：150 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
上篇 文獻(xiàn)綜述
    1 軟腐腸桿菌概述
    2 軟腐果膠桿菌致病因子
        2.1 胞外植物細(xì)胞壁降解酶
    3 Ⅵ分泌系統(tǒng)
        3.1 Ⅵ分泌系統(tǒng)的組成
    4 Hfq蛋白的研究
        4.1 Hfq的結(jié)構(gòu)
        4.2 Hfq蛋白對細(xì)菌毒力的影響
        4.3 Hfq蛋白多效性作用
        4.4 Hfq蛋白對Ⅲ型分泌系統(tǒng)的調(diào)控
        4.5 Hfq對基因的全局調(diào)控作用
        4.6 Hfq與靶標(biāo)sNA
    5 細(xì)菌sRNAs的研究
        5.1 sRNA調(diào)控蛋白活性
        5.2 基于堿基互補(bǔ)配對調(diào)控的sRNAs
    6 ArcZ研究進(jìn)展
        6.1 ArcZ促進(jìn)rpoS的翻譯
        6.2 ArcZ抑制flhDC的翻譯
        6.3 ArcZ對其他基因的調(diào)控作用
    7 本文研究的目的及與意義
下篇 研究內(nèi)容
    第一章 軟腐果膠桿菌Hfq蛋白的功能研究
        1 引言
        2 供試材料
            2.1 本研究所用菌株、質(zhì)粒和引物
        3 試驗方法
            3.1 菌株培養(yǎng)
            3.2 細(xì)菌基因組DNA提取
            3.3 質(zhì)粒的提取
            3.4 細(xì)菌RNA的提取
            3.5 DNA回收
            3.6 DNA片段和質(zhì)粒的酶切、回收及連接反應(yīng)
            3.7 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化
            3.8 缺失突變體及互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
            3.9 生物學(xué)表型測定
            3.10 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)
            3.11 轉(zhuǎn)錄組測序及分析
            3.12 Western blot雜交檢測
            3.13 寄主植物胼胝質(zhì)沉積的檢測
        4 結(jié)果與分析
            4.1 目的基因的比對
            4.2 hfq缺失突變株及其互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
            4.3 hfq缺失突變株的致病能力顯著下降
            4.4 Hfq對菌株P(guān)ccS1生長能力的影響
            4.5 hfq缺失突變株的胞外酶產(chǎn)量降低
            4.6 hfq缺失突變株的碳青霉烯抗生素活性降低
            4.7 hfq缺失突變株的游動性及生物膜產(chǎn)生能力下降
            4.8 Hfq抑制病原體相關(guān)分子誘導(dǎo)的寄主植物的胼胝質(zhì)沉積
            4.9 Hfq促進(jìn)Hcp蛋白的分泌及T6SS基因簇基因的表達(dá)
            4.10 Hfq對菌株P(guān)ccS1基因的全局調(diào)控作用
        5 小結(jié)與討論
    第二章 軟腐果膠桿菌sRNAs的功能研究
        1 引言
        2 實驗材料
            2.1 本研究所用菌株、質(zhì)粒和引物
        3 試驗方法
            3.1 菌株培養(yǎng)
            3.2 細(xì)菌基因組DNA提取
            3.3 質(zhì)粒提取
            3.4 細(xì)菌RNA的提取
            3.5 DNA回收
            3.6 DNA片段和質(zhì)粒的酶切、回收及連接反應(yīng)
            3.7 質(zhì)粒DNA的熱激轉(zhuǎn)化
            3.8 突變體及其互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
            3.9 生物學(xué)表型測定
            3.10 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)
            3.11 Western blot雜交檢測
        4 結(jié)果與分析
            4.1 sRNAs的預(yù)測
            4.2 sRNAs缺失突變體的構(gòu)建
            4.3 ArcZ,CsrB,SraG缺失對菌株P(guān)ccS1致病能力具有顯著影響
            4.4 ArcZ序列比對
            4.5 ArcZ互補(bǔ)及過表達(dá)菌株的構(gòu)建及致病能力的檢測
            4.6 ArcZ對菌株P(guān)ccS1生長能力沒有影響
            4.7 arcZ缺失突變株的胞外酶活性降低
            4.8 arcZ缺失突變株的碳青霉烯抗生素活性降低
            4.9 arcZ缺失突變株的游動性增強(qiáng)而生物膜產(chǎn)生能力下降
            4.10 ArcZ影響Hcp蛋白的分泌
        5 小結(jié)與討論
    第三章 軟腐果膠桿菌ArcZ靶標(biāo)基因的篩選與功能分析
        1 引言
        2 實驗材料
            2.1 本研究所用菌株,質(zhì)粒及引物
        3 試驗方法
            3.1 菌株培養(yǎng)
            3.2 細(xì)菌基因組DNA提取
            3.3 質(zhì)粒提取
            3.4 細(xì)菌RNA的提取
            3.5 DNA回收
            3.6 DNA片段和質(zhì)粒的酶切、回收及連接反應(yīng)
            3.7 質(zhì)粒DNA的熱激轉(zhuǎn)化
            3.8 生物學(xué)表型測定
            3.9 實時熒光定量PCR (qRT-PCR)
            3.10 Western blot雜交檢測
            3.11 RNA-seq
            3.12 點突變構(gòu)建
        4 結(jié)果與分析
            4.1 ΔarcZ(T1-P_BAD-arcZ),ΔarcZ(T1-P_BAD)及ΔarcZ(T1-P_BAD-arcZ^*)菌株的構(gòu)建
            4.2 arcZ表達(dá)量qRT-PCR檢測
            4.3 阿拉伯糖誘導(dǎo)arcZ表達(dá)部分恢復(fù)致病能力
            4.4 阿拉伯糖誘導(dǎo)arcZ表達(dá)恢復(fù)胞外酶至野生型水平
            4.5 生物信息學(xué)預(yù)測ArcZ的靶標(biāo)基因
            4.6 利用RNA-seq篩選ArcZ的靶標(biāo)基因
            4.7 差異表達(dá)基因的qRT-PCR檢測
            4.8 潛在靶標(biāo)基因的缺失突變體及過表達(dá)菌株的構(gòu)建
            4.9 潛在靶標(biāo)基因的致病性測定
            4.10 ArcZ促進(jìn)rpoS的表達(dá)
        5 小結(jié)與討論
全文總結(jié)
本文創(chuàng)新點
參考文獻(xiàn)
附錄1 培養(yǎng)基及試劑溶液的配制
附錄2 RNA-Seq差異表達(dá)基因
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文
致謝



本文編號：3826802