發(fā)布時(shí)間：2023-03-23 02:51

　　水稻干尖線蟲(chóng)(Aphelenchoides besseyi)是一種遷移性植物地上部寄生線蟲(chóng)、危害多種植物。脂肪酸和維生素A結(jié)合蛋白(Fatty acid-and retinol-binding proteins,FAR)是線蟲(chóng)特有蛋白,在線蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)吸收、調(diào)控寄主的組織以及抑制寄主的防衛(wèi)反應(yīng)方面具有重要的作用,因此是一種具有應(yīng)用前景的防治寄生線蟲(chóng)的靶標(biāo),近些年受到廣泛關(guān)注�；虺聊�(RNAi)是一種研究植物寄生線蟲(chóng)基因功能的強(qiáng)大工具,在植物寄生線蟲(chóng)RNAi研究中,目前普遍采用浸泡和植物介導(dǎo)的方法,但是兩者均存在一些問(wèn)題,制約其在植物寄生線蟲(chóng)基因功能研究中的應(yīng)用。因此,根據(jù)不同類型植物寄生線蟲(chóng)的生物學(xué)特性,研究建立更合理、更簡(jiǎn)便和更有效的RNAi方法是十分必要的。本研究利用實(shí)驗(yàn)室已有的水稻干尖線蟲(chóng)2個(gè)種群的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),分析和篩選得到與脂肪酸和維生素A結(jié)合蛋白基因相似的轉(zhuǎn)錄本序列。利用RACE技術(shù),鑒定和擴(kuò)增了水稻干尖線蟲(chóng)的7個(gè)新Ab-far基因,利用生物信息學(xué)方法對(duì)7個(gè)Ab-far基因的結(jié)構(gòu)和特征進(jìn)行分析;對(duì)這些基因進(jìn)行原核表達(dá),應(yīng)用熒光光譜測(cè)定法對(duì)對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行配體結(jié)合實(shí)驗(yàn);運(yùn)用qP...

【文章頁(yè)數(shù)】：153 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮寫(xiě)詞及英漢對(duì)照
第1章 前言
    1.1 研究背景
        1.1.1 水稻干尖線蟲(chóng)的分類地位及形態(tài)特征
        1.1.2 水稻干尖線蟲(chóng)的生物學(xué)特性
        1.1.3 水稻干尖線蟲(chóng)的分布及其寄主
        1.1.4 水稻干尖線蟲(chóng)的發(fā)生和危害
        1.1.5 水稻干尖線蟲(chóng)的防治
        1.1.6 植物寄生線蟲(chóng)的效應(yīng)子
        1.1.7 線蟲(chóng)脂肪酸和維生素A結(jié)合蛋白的研究現(xiàn)狀
        1.1.8 植物線蟲(chóng)功能基因研究的方法和技術(shù)
    1.2 研究目的和意義
        1.2.1 水稻干尖線蟲(chóng)脂肪酸和維生素A結(jié)合蛋白家族基因的克隆和功能分析
        1.2.2 真菌介導(dǎo)的RNAi方法構(gòu)建及研究Ab-far基因防治水稻干尖線蟲(chóng)的機(jī)制
第2章 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白家族基因的克隆和結(jié)構(gòu)分析
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 材料
            2.2.1.1 供試線蟲(chóng)
            2.2.1.2 供試植物材料、菌種和質(zhì)粒載體
            2.2.1.3 主要試劑及配制
            2.2.1.4 常用儀器設(shè)備
        2.2.2 方法
            2.2.2.1 水稻干尖線蟲(chóng)的培養(yǎng)繁殖
            2.2.2.2 水稻干尖線蟲(chóng)RNA的提取
            2.2.2.3 水稻干尖線蟲(chóng)DNA的微量提取
            2.2.2.4 3’RACE和5’RACEcDNA合成
            2.2.2.5 cDNA的合成
            2.2.2.6 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白家族基因cDNA和基因組DNA全長(zhǎng)克隆
            2.2.2.7 PCR產(chǎn)物純化回收
            2.2.2.8 PCR產(chǎn)物克隆及測(cè)序
            2.2.2.9 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的少量快速提取
            2.2.2.10 序列生物信息學(xué)分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白家族基因的克隆及其分析
        2.3.2 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白家族基因cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增及其序列分析
        2.3.3 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白家族基因編碼的氨基酸序列分析
            2.3.3.1 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白家族基因編碼的氨基酸序列特征
            2.3.3.2 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白的三維結(jié)構(gòu)分析
            2.3.3.3 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白的亞細(xì)胞定位
            2.3.3.4 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)
            2.3.3.5 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白的疏水/親水性分析
            2.3.3.6 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)
            2.3.3.7 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白的糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)
            2.3.3.8 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)
            2.3.3.9 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白的同源性分析
        2.3.4 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白家族基因編碼區(qū)擴(kuò)增
    2.4 小結(jié)
第3章 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白家族基因的表達(dá)模式和功能分析
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 材料
            3.2.1.1 供試線蟲(chóng)
            3.2.1.2 供試植物材料、菌種和質(zhì)粒載體
            3.2.1.3 主要試劑及配制
            3.2.1.4 常用儀器設(shè)備
        3.2.2 方法
            3.2.2.1 水稻干尖線蟲(chóng)的培養(yǎng)繁殖
            3.2.2.2 水稻干尖線蟲(chóng)Ab-far-2^Ab-far-8基因的原核表達(dá)
            3.2.2.3 熒光光譜法檢測(cè)四種FAR蛋白的配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)
            3.2.2.4 水稻干尖線蟲(chóng)Ab-far-2^Ab-far-8基因的Southern雜交
            3.2.2.5 水稻干尖線蟲(chóng)Ab-far-2^Ab-far-8基因的原位雜交
            3.2.2.6 水稻干尖線蟲(chóng)Ab-far-2^Ab-far-8基因的表達(dá)量分析
            3.2.2.7 水稻干尖線蟲(chóng)Ab-far-2和Ab-far-4基因的體外RNAi分析
            3.2.2.8 數(shù)據(jù)分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白的表達(dá)和功能分析
            3.3.1.1 水稻干尖線蟲(chóng)Ab-FAR-2^Ab-FAR-8的原核表達(dá)及蛋白純化結(jié)果
            3.3.1.2 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白配合基和配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)
        3.3.2 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白家族基因Southern雜交
        3.3.3 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白家族基因的原位雜交
        3.3.4 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白家族基因的表達(dá)量分析
        3.3.5 水稻干尖線蟲(chóng)Ab-far-2和Ab-far-4基因的體外RNAi分析
            3.3.5.1 Ab-far-2和Ab-far-4基因的沉默效率
            3.3.5.2 Ab-far-2和Ab-far-4基因沉默對(duì)水稻干尖線蟲(chóng)繁殖的影響
    3.4 小結(jié)
第4章 灰葡萄孢菌介導(dǎo)的Ab-farRNAi研究
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 材料
            4.2.1.1 供試線蟲(chóng)
            4.2.1.2 供試植物材料、菌種和質(zhì)粒載體
            4.2.1.3 主要試劑及配制
            4.2.1.4 常用儀器設(shè)備
        4.2.2 方法
            4.2.2.1 水稻干尖線蟲(chóng)和灰葡萄孢菌的培養(yǎng)
            4.2.2.2 水稻干尖線蟲(chóng)Ab-far-1RNAi真菌表達(dá)載體的構(gòu)建
            4.2.2.3 Ab-far-1RNAi真菌表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
            4.2.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化灰葡萄孢菌
            4.2.2.5 轉(zhuǎn)基因真菌的分子鑒定
            4.2.2.6 潮霉素和空載體對(duì)灰葡萄孢菌生長(zhǎng)和水稻干尖線蟲(chóng)繁殖量的影響
            4.2.2.7 Ab-far-1基因沉默后水稻干尖線蟲(chóng)的形態(tài)測(cè)量值
            4.2.2.8 水稻干尖線蟲(chóng)在轉(zhuǎn)基因灰葡萄孢菌上的繁殖力及其Ab-far-1基因表達(dá)量
            4.2.2.9 水稻干尖線蟲(chóng)取食轉(zhuǎn)基因真菌后對(duì)擬南芥的致病性
            4.2.2.10 取食轉(zhuǎn)基因真菌的水稻干尖線蟲(chóng)在擬南芥上寄生繁殖后代的目的基因表達(dá)量檢測(cè)
            4.2.2.11 數(shù)據(jù)分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 轉(zhuǎn)Ab-far-1dsRNA真菌的產(chǎn)生和分析
            4.3.1.1 空載體pBS質(zhì)粒的構(gòu)建
            4.3.1.2 真菌表達(dá)載體pBS2-Ab-far-1的構(gòu)建
            4.3.1.3 真菌表達(dá)對(duì)照載體pBS-eGFP2的構(gòu)建
            4.3.1.4 Ab-far-1dsRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
            4.3.1.5 轉(zhuǎn)Ab-far-1dsRNA真菌的獲得及分子檢測(cè)
        4.3.2 潮霉素和空載體對(duì)轉(zhuǎn)基因真菌和水稻干尖線蟲(chóng)生長(zhǎng)和繁殖情況的影響
        4.3.3 水稻干尖線蟲(chóng)取食轉(zhuǎn)Ab-far-1dsRNA灰葡萄孢菌后形態(tài)表型變化
        4.3.4 水稻干尖線蟲(chóng)取食轉(zhuǎn)Ab-far-1dsRNA灰葡萄孢菌后的繁殖量和Ab-far-1表達(dá)量
        4.3.5 灰葡萄菌介導(dǎo)的Ab-far-1沉默對(duì)水稻干尖線蟲(chóng)致病力影響及其沉默效應(yīng)的持效性和可遺傳性
    4.4 小結(jié)
第5章 全文討論與結(jié)論
    5.1 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白家族基因的克隆和結(jié)構(gòu)
    5.2 水稻干尖線蟲(chóng)FAR蛋白家族基因的表達(dá)模式和功能的多樣性
    5.3 灰葡萄孢菌介導(dǎo)的Ab-farRNAi
    5.4 本研究的創(chuàng)新性
    5.5 研究展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄A 主要試劑及配制
附錄B 常用儀器設(shè)備
附錄C 水稻干尖線蟲(chóng)8個(gè)Ab-far基因的轉(zhuǎn)錄本序列、cDNA和DNA全長(zhǎng)序列
附錄D 本研究所使用的引物
附錄E 博士在讀期間參與發(fā)表論文和申請(qǐng)專利



本文編號(hào)：3768130