糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)是一種在世界范圍內(nèi)廣泛栽培的食用菌,不僅味道鮮美,而且營養(yǎng)價值高,深受人們的喜愛。目前,國內(nèi)外對糙皮側(cè)耳的研究主要集中在栽培育種、相關(guān)基因的克隆和表達、次級代謝產(chǎn)物的分離純化及將糙皮側(cè)耳作為生物轉(zhuǎn)化的工具等,對糙皮側(cè)耳發(fā)育相關(guān)基因功能研究則嚴重滯后。本實驗比較了糙皮側(cè)耳不同長度gpd啟動子對其驅(qū)動效率的影響,選擇了高效的795bp gpd啟動子片段成功構(gòu)建了適用于糙皮側(cè)耳的超表達載體和RNAi載體,對甲硫氨酸亞砜還原酶和錳超氧化物歧化酶等發(fā)育相關(guān)基因的功能進行了系統(tǒng)研究。具體研究結(jié)果如下:1.糙皮側(cè)耳發(fā)育相關(guān)基因的克隆及鑒定對菌絲體階段表達的119個Tag進行c DNA 3′末端克隆,其中成功獲得3′末端序列的Tag有83個,檢出率為69.7%。將獲得的基因3′末端序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對,有41個3′末端序列與數(shù)據(jù)庫中注釋的基因得到較好的匹配,匹配率為49.4%。在匹配性較好的41個基因中有17個重要酶基因,由于這些酶基因?qū)?yīng)的Tag具有較高的表達量,因此我們認為這些酶基因可能在糙皮側(cè)耳分化發(fā)育過程中起著重要的作用,其具體功能...

【文章頁數(shù)】：242 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要縮略語表
第一章 文獻綜述
    1 糙皮側(cè)耳的遺傳特性及生活史
    2 糙皮側(cè)耳重要應(yīng)用價值
        2.1 營養(yǎng)價值和藥用價值
        2.2 在環(huán)境保護方面的應(yīng)用
        2.3 在工業(yè)方面的應(yīng)用
    3 糙皮側(cè)耳分子生物學研究
        3.1 糙皮側(cè)耳發(fā)育相關(guān)基因的獲得
        3.2 糙皮側(cè)耳功能基因的研究狀況
    4 高等真菌的遺傳轉(zhuǎn)化研究進展
        4.1 PEG-LiCl/PEG-CaCl2 介導的遺傳轉(zhuǎn)化
        4.2 電擊轉(zhuǎn)化法
        4.3 基因槍法
        4.4 限制性酶介導的整合法
        4.5 沖擊波介導的遺傳轉(zhuǎn)化
        4.6 根癌農(nóng)桿菌介導的高等真菌遺傳轉(zhuǎn)化
            4.6.1 根癌農(nóng)桿菌介導的高等真菌轉(zhuǎn)化機理及特點
            4.6.2 根癌農(nóng)桿菌介導真菌轉(zhuǎn)化的影響因素
            4.6.3 根癌農(nóng)桿菌介導高等真菌遺傳轉(zhuǎn)化的應(yīng)用前景
    5 高等真菌基因功能研究方法
        5.1 甘油醛3磷酸脫氫酶基因啟動子
        5.2 基因敲除技術(shù)
        5.3 超表達技術(shù)
        5.4 RNA干涉技術(shù)
            5.4.1 RNAi的分子機制
            5.4.2 真菌中RNAi的不同途徑及涉及的酶系
            5.4.3 真菌中RNAi高效載體的構(gòu)建
            5.4.4 RNAi在真菌基因功能研究中的應(yīng)用前景
        5.5 其他方法
    6 本課題研究目的意義及主要內(nèi)容
第二章基于DGE文庫的糙皮側(cè)耳發(fā)育相關(guān)基因的篩選及克隆
    1 材料與方法
        1.1 菌株及質(zhì)粒載體
        1.2 主要試劑與設(shè)備
            1.2.1 酶和生化試劑
            1.2.2 主要儀器與設(shè)備
        1.3 實驗溶液與培養(yǎng)基的配制
        1.4 實驗方法
            1.4.1 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞的制備
            1.4.2 糙皮側(cè)耳基因組DNA的提取
            1.4.3 糙皮側(cè)耳總RNA的提取
            1.4.4 cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成
            1.4.5 雙鏈cDNA的酶切
            1.4.6 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件
            1.4.7 PCR產(chǎn)物的純化
            1.4.8 PCR片段的連接及菌落PCR反應(yīng)
            1.4.9 部分基因 5′末端的克隆
    2 結(jié)果與分析
        2.1 糙皮側(cè)耳菌絲體基因組DNA及總RNA的提取
        2.2 部分Tag所對應(yīng)基因的cDNA 3′端的克隆
        2.3 部分Tag所對應(yīng)基因的cDNA 3′端測序結(jié)果分析
        2.4 部分糙皮側(cè)耳菌絲體表達基因cDNA 5′端的克隆
        2.5 部分糙皮側(cè)耳菌絲體表達基因cDNA全長拼接
        2.6 部分糙皮側(cè)耳菌絲體表達基因DNA的克隆
        2.7 部分糙皮側(cè)耳菌絲體表達基因序列初步分析
    3 討論
        3.1 數(shù)字基因表達譜文庫
        3.2 高表達量Tag對應(yīng)基因的克隆
        3.3 凝集素基因（Lectin）
第三章 糙皮側(cè)耳ASP和Mn-SOD基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 主要試劑和設(shè)備
            1.2.1 酶和生化試劑
            1.2.2 主要儀器與設(shè)備
        1.3 實驗溶液與培養(yǎng)基的配置
            1.3.1 主要溶液的配制
            1.3.2 主要培養(yǎng)基的配制
        1.4 實驗方法
            1.4.1 畢赤酵母GS115 感受態(tài)細胞制備
            1.4.2 引物設(shè)計
            1.4.3 ASP和SOD基因CDS序列的分離
            1.4.4 ASP和SOD基因畢赤酵母表達載體的構(gòu)建
            1.4.5 pPIC9K-ASP和pPIC9K-SOD質(zhì)粒的線性化及電轉(zhuǎn)化
            1.4.6 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定與篩選
            1.4.7 畢赤酵母工程菌的培養(yǎng)和目標產(chǎn)物的誘導分泌表達
            1.4.8 發(fā)酵液中蛋白含量的測定
            1.4.9 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析
            1.4.10 Western blot分析
            1.4.11 重組天冬氨酸蛋白酶和錳超氧化物歧化酶的初步分離
            1.4.12 天冬氨酸蛋白酶凝乳性質(zhì)測定
            1.4.13 錳超氧化物歧化酶酶學性質(zhì)測定
            1.4.14 畢赤酵母發(fā)酵條件的優(yōu)化
    2 結(jié)果與分析
        2.1 ASP和SOD基因片段分離
        2.2 ASP和SOD基因全序列分析
        2.3 ASP和SOD基因生物信息學分析
        2.4 ASP和SOD基因表達載體的構(gòu)建
        2.5 表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115 及轉(zhuǎn)化子的篩選
            2.5.1 酵母轉(zhuǎn)化子的甲醇利用表型的篩選
            2.5.2 酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定
            2.5.3 ASP和Mn-SOD基因多拷貝整合子的篩選
        2.6 ASP和Mn-SOD基因在P. pastoris中的表達及表達產(chǎn)物的檢測
            2.6.1 高表達酵母菌株的篩選
            2.6.2 酵母工程菌表達產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測
            2.6.3 酵母工程菌表達產(chǎn)物的Western blot檢測
        2.7 重組天冬氨酸蛋白酶和錳超氧化物歧化酶性質(zhì)鑒定
            2.7.1 重組天冬氨酸蛋白酶凝乳性質(zhì)測定
            2.7.2 錳超氧化物歧化酶的鑒定
        2.8 重組錳超氧化物歧化酶酵母轉(zhuǎn)化子發(fā)酵條件的優(yōu)化
            2.8.1 培養(yǎng)基起始pH對發(fā)酵的影響
            2.8.2 誘導時間對發(fā)酵的影響
            2.8.3 甲醇添加量對發(fā)酵的影響
    3 討論
        3.1 巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的選擇
        3.2 分泌表達方式的選擇
        3.3 影響畢赤酵母外源蛋白表達量的因素及表達條件的優(yōu)化
第四章 不同長度gpd啟動子對其驅(qū)動效率的影響
    1 材料與方法
        1.1 菌株及質(zhì)粒載體
        1.2 主要試劑和設(shè)備
            1.2.1 酶和生化試劑
            1.2.2 主要實驗設(shè)備
        1.3 溶液和培養(yǎng)基的配制
            1.3.1 主要溶液的配制
            1.3.2 主要培養(yǎng)基的配制
        1.4 實驗方法
            1.4.1 細菌感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化
            1.4.2 不同長度gpd啟動子的克隆
            1.4.3 中間載體pMD-egfp的構(gòu)建
            1.4.4 中間載體pMD-gpd-egfp的構(gòu)建
            1.4.5 表達載體pCAMBIA-gpd-egfp-hph的構(gòu)建
            1.4.6 pCAMBIA-gpd-egfp-hph質(zhì)粒電轉(zhuǎn)根癌農(nóng)桿菌
            1.4.7 根癌農(nóng)桿菌介導的糙皮側(cè)耳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建
            1.4.8 轉(zhuǎn)化子的篩選及分子生物學分析
            1.4.9 綠色熒光蛋白表達分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 糙皮側(cè)耳gpd啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點分析
        2.2 不同長度gpd啟動子片段的克隆
        2.3 中間載體pMD-egfp和pMD-gpd-egfp的構(gòu)建
        2.4 融合表達載體pCAMBIA-gpd-egfp-hph的構(gòu)建
        2.5 根癌農(nóng)桿菌介導糙皮側(cè)耳菌絲體的轉(zhuǎn)化及篩選
            2.5.1 抗生素敏感性測定
            2.5.2 糙皮側(cè)耳菌絲體的轉(zhuǎn)化及篩選
        2.6 糙皮側(cè)耳菌絲體轉(zhuǎn)化子的驗證
            2.6.1 轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性及PCR篩選
            2.6.2 轉(zhuǎn)化子的Southern blot驗證
        2.7 不同長度gpd啟動子片段驅(qū)動綠色熒光蛋白表達效率分析
            2.7.1 熒光顯微鏡觀察
            2.7.2 熒光定量PCR分析
            2.7.3 熒光值的測定
            2.7.4 Western blot分析
    3 討論
        3.1 根癌農(nóng)桿菌介導真菌遺傳轉(zhuǎn)化條件的選擇
        3.2 不同長度gpd啟動子對其驅(qū)動效率的影響
第五章 糙皮側(cè)耳MsrA基因超表達及其抗逆性的研究
    1 材料與方法
        1.1 質(zhì)粒載體
        1.2 主要試劑和設(shè)備
        1.3 溶液和培養(yǎng)基的配制
            1.3.1 主要溶液的配制
            1.3.2 主要培養(yǎng)基的配制
        1.4 實驗方法
            1.4.1 糙皮側(cè)耳甲硫氨酸亞砜還原酶A基因（PoMsrA）的克隆
            1.4.2 表達中間載體pGEH的構(gòu)建
            1.4.3 表達載體pGEH-EM的構(gòu)建
            1.4.4 pGEH-EM質(zhì)粒電轉(zhuǎn)根癌農(nóng)桿菌
            1.4.5 根癌農(nóng)桿菌介導的糙皮側(cè)耳菌絲體轉(zhuǎn)化
            1.4.6 轉(zhuǎn)化子的篩選及分子生物學鑒定
            1.4.7 轉(zhuǎn)基因菌株抗逆性實驗
            1.4.8 非生物脅迫條件下PoMsrA基因表達分析
            1.4.9 不同生長階段PoMsrA基因表達分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 糙皮側(cè)耳PoMsrA基因的克隆
        2.2 糙皮側(cè)耳PoMsrA基因序列的生物信息學分析
        2.3 糙皮側(cè)耳PoMsrA基因超表達載體的構(gòu)建
            2.3.1 表達中間載體pGEH的構(gòu)建
            2.3.2 表達載體pGEH-EM的構(gòu)建
        2.4 根癌農(nóng)桿菌介導糙皮側(cè)耳菌絲體的轉(zhuǎn)化及篩選
            2.4.1 糙皮側(cè)耳菌絲體的轉(zhuǎn)化
            2.4.2 轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定
            2.4.3 轉(zhuǎn)化子的Southern bot驗證
            2.4.4 轉(zhuǎn)化子的熒光觀察
        2.5 轉(zhuǎn)化子在不同逆境中的生長情況
        2.6 不同脅迫條件下PoMsrA基因表達情況研究
        2.7 不同生長階段PoMsrA基因表達情況研究
    3 討論
        3.1 甲硫氨酸亞砜還原酶A的結(jié)構(gòu)
        3.2 甲硫氨酸亞砜還原酶A的分布
        3.3 甲硫氨酸亞砜還原酶A的功能
第六章 糙皮側(cè)耳錳超氧化物歧化酶基因功能研究
    1 材料與方法
        1.1 質(zhì)粒載體
        1.2 主要試劑和設(shè)備
        1.3 溶液和培養(yǎng)基的配制
        1.4 實驗方法
            1.4.1 糙皮側(cè)耳錳超氧化物歧化酶基因（PoMn-SOD）的克隆
            1.4.2 中間載體pGEH的構(gòu)建
            1.4.3 表達載體pGEH-ES的構(gòu)建
            1.4.4 干涉載體pGEH-RI的構(gòu)建
            1.4.5 pGEH-EM和pGEH-RI質(zhì)粒電轉(zhuǎn)根癌農(nóng)桿菌
            1.4.6 根癌農(nóng)桿菌介導的糙皮側(cè)耳菌絲體轉(zhuǎn)化
            1.4.7 轉(zhuǎn)化子的篩選及分子生物學鑒定
            1.4.8 轉(zhuǎn)基因菌株中PoMn-SOD基因表達分析
            1.4.9 共沉默現(xiàn)象的驗證
            1.4.10 轉(zhuǎn)基因菌株抗逆性實驗
            1.4.11 超表達菌株非生物脅迫條件下PoMn-SOD基因表達分析 .. 154 1.4.12 轉(zhuǎn)基因菌株不同生長階段PoMn-SOD基因表達分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 糙皮側(cè)耳PoMn-SOD基因的克隆
        2.2 糙皮側(cè)耳PoMn-SOD基因序列生物信息學分析
        2.3 糙皮側(cè)耳PoMn-SOD基因超表達載體的構(gòu)建
            2.3.1 表達中間載體pGEH的構(gòu)建
            2.3.2 表達載體pGEH-EM的構(gòu)建
        2.4 糙皮側(cè)耳PoMn-SOD基因RNA干涉載體的構(gòu)建
        2.5 根癌農(nóng)桿菌介導糙皮側(cè)耳菌絲體的轉(zhuǎn)化及篩選
            2.5.1 糙皮側(cè)耳菌絲體的轉(zhuǎn)化
            2.5.2 轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定
            2.5.3 轉(zhuǎn)化子的Southern bot驗證
            2.5.4 轉(zhuǎn)化子的熒光觀察
        2.6 轉(zhuǎn)基因菌株中PoMn-SOD基因表達情況分析
            2.6.1 轉(zhuǎn)基因菌株中PoMn-SOD基因表達分析
            2.6.2 RNA干涉引起的共沉默
        2.7 轉(zhuǎn)基因菌株的抗逆性研究
        2.8 不同生長階段轉(zhuǎn)基因菌株中PoMn-SOD基因表達分析
    3 討論
        3.1 RNA干涉效率
        3.2 RNAi在真菌基因功能研究中的優(yōu)缺點
第七章 結(jié)論與展望
    1. 結(jié)論
    2. 展望
    3. 論文創(chuàng)新點
參考文獻
附錄1 DGE文庫篩選相關(guān)引物
附錄2 序列比對相關(guān)圖
附錄3 Mn-SOD基因序列
附錄4 論文發(fā)表情況
致謝



本文編號：3768362