雞球蟲病是危害養(yǎng)雞業(yè)最為嚴重的寄生蟲病之一,每年給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。耐藥蟲株的出現(xiàn)、藥物殘留、雞球蟲活疫苗生產(chǎn)成本昂貴、散毒等問題,使雞球蟲病的防控面臨更嚴峻的挑戰(zhàn)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展,安全無毒的第三代疫苗被認為是理想的抗球蟲疫苗;而篩選鑒定免疫原性強的保護性抗原和種特異性抗原是研發(fā)第三代疫苗的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。本研究應(yīng)用比較免疫蛋白質(zhì)組學(xué)對E.tenella特異性抗原組進行篩選鑒定;通過免疫原性試驗鑒定E.tenella特異性抗原,并對其功能進行研究;為雞球蟲新型亞單位疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)和新思路。研究內(nèi)容具體包括以下六個方面:1、E.tenella和E.maxima高免血清的制備和鑒定本研究通過口服感染雞球蟲卵囊制備E.tenella和E.maxima高免血清,應(yīng)用ELISA、Western blot、體外阻斷及被動免疫等試驗對抗體質(zhì)量進行評價。ELISA結(jié)果顯示,隨著接種次數(shù)的增多,血清抗體滴度升高,且第五次接種8天后血清抗體滴度達到高峰。以制備的高免血清為一抗對裂殖子全蛋白進行Western blot分析,結(jié)果顯示,E.tenella免疫血清識別的抗原種類和反應(yīng)強度均高...

【文章頁數(shù)】：149 頁

【學(xué)位級別】：博士

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中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 雞球蟲病概述
        1.1.1 病原生物學(xué)
        1.1.2 雞球蟲生活史
        1.1.3 雞球蟲病流行病學(xué)及危害
    1.2 雞球蟲免疫研究進展
        1.2.1 雞球蟲抗原的種類
        1.2.2 天然免疫反應(yīng)
        1.2.3 細胞免疫
        1.2.4 體液免疫
    1.3 雞球蟲病防控研究進展
        1.3.1 雞球蟲病的藥物防控
        1.3.2 雞球蟲病的疫苗防控
    1.4 蛋白質(zhì)組學(xué)在球蟲疫苗研發(fā)中的應(yīng)用
        1.4.1 蛋白質(zhì)組學(xué)概述
        1.4.2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)
        1.4.3 免疫蛋白質(zhì)組學(xué)
        1.4.4 蛋白質(zhì)組學(xué)在雞球蟲抗原鑒定中的應(yīng)用
    1.5 本研究的意義
2 材料方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 試驗質(zhì)粒、菌株、蟲體、細胞
        2.1.2 試驗動物
        2.1.3 主要試劑與藥品
        2.1.4 主要儀器、設(shè)備
    2.2 試驗方法
        2.2.1 高免血清的制備
        2.2.2 子孢子的分離純化
        2.2.3 裂殖子的分離純化
        2.2.4 裂殖子蛋白質(zhì)的抽提
        2.2.5 免疫差異蛋白質(zhì)雙向電泳
        2.2.6 RNA的提取
        2.2.7 反轉(zhuǎn)錄合成c DNA
        2.2.8 熒光定量PCR
        2.2.9 基因PCR擴增及產(chǎn)物回收
        2.2.10 大腸桿菌感受態(tài)的制備
        2.2.11 Blunt載體的制備
        2.2.12 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.13 原核表達
        2.2.14 SDS-PAGE分析
        2.2.15 His重組蛋白的純化
        2.2.16 鼠源多克隆抗體的制備
        2.2.17 組織蛋白抽提
        2.2.18 Western blot實驗
        2.2.19 酵母表面展示
        2.2.20 間接免疫熒光實驗
        2.2.21 多抗抑制子孢子入侵實驗
        2.2.22 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)
        2.2.23 抗球蟲指數(shù)ACI計算
        2.2.24 細胞轉(zhuǎn)染
        2.2.25 免疫共沉淀
        2.2.26 數(shù)據(jù)分析
3 結(jié)果
    3.1 柔嫩和巨型艾美爾球蟲高免血清的制備與鑒定
        3.1.1 柔嫩和巨型艾美爾球蟲高免血清的制備
        3.1.2 柔嫩和巨型艾美爾球蟲高免血清的體外鑒定
        3.1.3 柔嫩和巨型艾美爾球蟲高免血清的體內(nèi)鑒定
    3.2 柔嫩艾美爾球蟲差異蛋白質(zhì)組的篩選、鑒定
        3.2.1 柔嫩艾美爾球蟲裂殖子蛋白雙向電泳分析
        3.2.2 柔嫩艾美爾球蟲裂殖子蛋白免疫蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果
        3.2.3 柔嫩艾美爾球蟲免疫差異基因的鑒定
        3.2.4 柔嫩艾美爾球蟲免疫差異蛋白質(zhì)表達、純化
        3.2.5 免疫蛋白質(zhì)組學(xué)可靠性檢測
    3.3 差異抗原功能初步分析
        3.3.1 差異抗原多克隆抗體的制備
        3.3.2 差異抗原不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄譜分析
        3.3.3 差異抗原在不同階段的表達和定位分析
        3.3.4差異抗原多克隆抗體體外抑制子孢子入侵實驗
    3.4 柔嫩艾美爾球蟲特異性抗原的鑒定
        3.4.1 巨型艾美爾球蟲同源基因的克隆、表達
        3.4.2 重組抗原免疫保護力評價
        3.4.3 重組抗原誘導(dǎo)體液免疫的能力
    3.5 特異性抗原CCT2 的功能研究
        3.5.1 EmCCT2 多抗的制備
        3.5.2 CCT2 多抗對子孢子入侵的抑制作用
        3.5.3 EtCCT2 與宿主細胞的相互作用
        3.5.4 EtCCT2 對宿主細胞的影響
        3.5.5 EmCCT2與EtCCT2 的功能差異
        3.5.6 EtCCT2對GgCCT4 表達的影響
        3.5.7 柔嫩艾美爾球蟲感染對宿主CCT4 表達的影響
    3.6 特異性抗原EtMIC1 表位及其關(guān)鍵氨基酸序列的鑒定
        3.6.1 表位的鑒定
        3.6.2 表位關(guān)鍵氨基酸的鑒定
        3.6.3 不同種艾美爾球蟲表位種特異性鑒定
        3.6.4 感染初期EtMIC1 亞細胞定位結(jié)果
        3.6.5 EtMIC1 表位及結(jié)構(gòu)域免疫保護力評價
        3.6.6 EtMIC1 表位誘導(dǎo)體液免疫和細胞免疫的能力
4 討論
    4.1 免疫蛋白質(zhì)組學(xué)具有篩選高效抗原的優(yōu)勢
    4.2 EtCCT2 可能是柔嫩艾美爾球蟲表面抗原
    4.3 柔嫩艾美爾球蟲Profilin樣蛋白是潛在候選抗原
    4.4 柔嫩艾美爾球蟲CCT2 可能是毒力因子
    4.5 ⁹¹LITFATRSK⁹⁹是EtMIC1 的關(guān)鍵抗原表位
5 結(jié)論
6 參考文獻
7 致謝
8 博士在讀期間發(fā)表的論文



本文編號：3764762