近年來(lái),豬偽狂犬病毒(PRV)變異株在我國(guó)爆發(fā),根據(jù)全基因組序列分析,該變異株屬于基因II型PRV。傳統(tǒng)的Bartha-K61疫苗不能對(duì)變異毒株提供完全保護(hù)。對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)具有很大的潛在威脅。因此,對(duì)變異毒株的研究迫在眉睫。PRV基因組較大,GC含量高,難于操作。所以本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)PRV進(jìn)行多方面研究。本研究首先應(yīng)用CRISPR-Cas9技術(shù)建立了高效編輯PRV基因組的平臺(tái),并應(yīng)用該平臺(tái)在短時(shí)間內(nèi)構(gòu)建了 gE/gl/TK三基因缺失毒株。該毒株在小鼠上失去了致病力,并且誘導(dǎo)小鼠機(jī)體免疫反應(yīng),抵抗PRV強(qiáng)毒株的攻擊。短時(shí)間內(nèi)構(gòu)建疫苗株對(duì)PRV的防控,特別是當(dāng)新型變異毒株爆發(fā)的防控極為重要。眾所周知,sgRNA的篩選是決定CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功與否的關(guān)鍵,應(yīng)用傳統(tǒng)的篩選方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究成功構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)EGFP，Luciferase的雙報(bào)告病毒。Luciferase活性可在感染4小時(shí)后檢測(cè)到。而且該病毒穩(wěn)定性良好。通過(guò)該報(bào)告病毒可以快速篩選sgRNA以及抗病毒藥物。本研究應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)建立了 DNA大片段缺失平臺(tái),敲除效率幾乎達(dá)到100%。最...

【文章頁(yè)數(shù)】：47 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 綜述
    1.1 PRV研究概況
    1.2 基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展
        1.2.1 ZFN技術(shù)
        1.2.2 TALLEN技術(shù)
        1.2.3 CRISPR技術(shù)
第二章 研究報(bào)告
    2.1 材料與方法
        2.1.1 PRV基因組的提取
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 PRV基因敲除平臺(tái)的建立
            2.2.1.1 有效sgRNA的篩選
            2.2.1.2 CRISPR/Cas9介導(dǎo)高效的PRV基因組編輯
            2.2.1.3 CRISPR/Cas9介導(dǎo)PRV基因gI與TK敲除
            2.2.1.4 gE-/gI-/TK-致病性評(píng)估
            2.2.1.5 gE-/gI-/TK-免疫保護(hù)評(píng)估
        2.2.2 高效篩選SgRNA平臺(tái)的建立
            2.2.2.1 表達(dá)EGF與Firefly Luciferase雙報(bào)告基因重組PRV的構(gòu)建
            2.2.2.2 應(yīng)用PRV-Luc-EGFP重組病毒篩選SgRNA
            2.2.2.3 應(yīng)用PRV-Luc-EGFP重組病毒篩選抗病毒藥物
        2.2.3 DNA大片段敲除平臺(tái)的建立
        2.2.4 CRISPR/Cas9在PRV抗病毒研究中的應(yīng)用
        2.2.5 CRISPR/Cas9技術(shù)篩選PRV變異毒株關(guān)鍵毒力基因
    2.3 討論
    2.4 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3738452