發(fā)布時間：2023-02-10 15:52

　　轉(zhuǎn)基因雞輸卵管生物反應(yīng)器具有高產(chǎn)蛋能力,轉(zhuǎn)基因雞群快速擴繁能力和與人類相似的蛋白糖基化形式,在藥用蛋白生產(chǎn)方面具有不可替代的作用。到目前為止,相繼建立了雞蛋卵白(eggwhite)中表達干擾素、溶菌酶、抗體、促紅細胞生成素、表皮生長因子等重組蛋白的轉(zhuǎn)基因雞。但是對于不同長度卵清蛋白啟動子(OVP)活性,以及雌激素應(yīng)答元件(ERE)和卵清蛋白上游啟動子轉(zhuǎn)錄因子(COUP-TF)調(diào)控作用缺乏系統(tǒng)研究;其次,作為外源基因轉(zhuǎn)移的有效載體,雞原始生殖細胞(PGCs)分離培養(yǎng)方法也待探討。本研究的目的是確定雞OVP核心區(qū)域,篩選高轉(zhuǎn)錄活性的OVP;探討ERE和COUP-TF調(diào)控作用;摸索雞PGCs適宜培養(yǎng)方法;通過體外和體內(nèi)驗證試驗,確定可望用于制備輸卵管生物反應(yīng)器的OVP。1.CRISPR-d Cas9-VP64介導(dǎo)的雞卵清蛋白啟動子轉(zhuǎn)錄活性分析。將啟動子cERE-cOVP-2785、cOVP-2785分別亞克隆至p GL3-Basic載體,構(gòu)建了熒光素酶表達載體p GL3-cERE-cOVP-2785、p GL3-cOVP-2785。利用Lipofectamine?2000將上述2個質(zhì)粒以及p...

【文章頁數(shù)】：147 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮寫符號說明
第一章 文獻綜述
    1.1 啟動子的概念
        1.1.1 核心啟動子元件(CPE)
        1.1.2 上游啟動子元件(UPE)
    1.2 雞卵清蛋白
        1.2.1 卵清蛋白簡介
        1.2.2 雞卵清蛋白的組織特異性與誘導(dǎo)表達
        1.2.3 卵清蛋白增強子序列
    1.3 雞卵清蛋白上游啟動子轉(zhuǎn)錄因子
        1.3.1 COUP-TFs作用的分子機制
        1.3.2 COUP-TFs的生理功能
    1.4 啟動子研究分析方法
        1.4.1 啟動子預(yù)測工具
        1.4.2 雙熒光素酶報告基因檢測
    1.5 CRISPR-d Cas9 與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控
        1.5.1 dCas9簡介
        1.5.2 CRISPR-d Cas9 轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制效應(yīng)元件
    1.6 雞原始生殖細胞
        1.6.1 雞胚原始生殖細胞的起源
        1.6.2 雞胚原始生殖細胞超微結(jié)構(gòu)
        1.6.3 PGCs的分離
        1.6.4 雞PGCs分離培養(yǎng)相關(guān)影響因素
        1.6.5 PGCs的生物學(xué)特性
        1.6.6 PGCs在轉(zhuǎn)基因家禽研究中的應(yīng)用
    1.7 輸卵管特異性表達轉(zhuǎn)基因雞研究
        1.7.1 轉(zhuǎn)基因雞研究方法
        1.7.2 輸卵管特異性表達轉(zhuǎn)基因雞研究簡史
        1.7.3 輸卵管特異基因的高通量篩選及其啟動子的應(yīng)用
        1.7.4 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的輸卵管特異性表達轉(zhuǎn)基因雞研究
    1.8 本研究的目的與意義
第二章 CRISPR-d Cas9-VP64 介導(dǎo)的雞卵清蛋白啟動子轉(zhuǎn)錄活性分析
    2.1 引言
    2.2 材料和試劑
        2.2.1 主要試劑
        2.2.2 主要儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 含雌激素應(yīng)答元件的啟動子片段(cERE-cOVP-2785)的克隆
        2.3.2 重組表達載體p GL3-cERE-cOVP-2785 的構(gòu)建
        2.3.3 重組表達載體p GL3-cOVP-2785 的構(gòu)建
        2.3.4 sgRNA的設(shè)計
        2.3.5 sgRNA表達載體構(gòu)建
        2.3.6 重組質(zhì)粒中量抽提
        2.3.7 轉(zhuǎn)染
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 啟動子載體構(gòu)建結(jié)果
        2.4.2 質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染最優(yōu)比例篩選
        2.4.3 不同長度啟動子活性的比較
        2.4.4 卵清蛋白啟動子(cERE-cOVP-2785)不同區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性分析
        2.4.5 雌激素對啟動子的影響
        2.4.6 激活雌激素應(yīng)答元件不同區(qū)域作用結(jié)果
    2.5 討論
    2.6 小結(jié)
第三章 雞卵清蛋白上游啟動子轉(zhuǎn)錄因子Ⅰ/Ⅱ功能分析
    3.1 引言
    3.2 材料和試劑
    3.3 實驗方法
        3.3.1 轉(zhuǎn)錄因子重組表達載體構(gòu)建
        3.3.2 去內(nèi)毒素重組質(zhì)粒提取
        3.3.3 COUP-TFⅠ/Ⅱ調(diào)控作用
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 含轉(zhuǎn)錄因子載體構(gòu)建結(jié)果
        3.4.2 COUP-TFⅠ與COUP-TFⅡ的調(diào)控作用
        3.4.3 兩個轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用分析
    3.5 討論
    3.6 小結(jié)
第四章 雞原始生殖細胞的分離及培養(yǎng)
    4.1 引言
    4.2 材料和試劑
        4.2.1 實驗材料
        4.2.2 主要儀器
        4.2.3 主要試劑
        4.2.4 有關(guān)溶液的配制
    4.3 實驗方法
        4.3.1 飼養(yǎng)層的準(zhǔn)備
        4.3.2 從5.5日齡的雞胚(28期)性腺中分離PGCs
        4.3.3 從2.5日齡的雞胚(14期)血液中分離PGCs
        4.3.4 雞PGCs的體外培養(yǎng)體系
        4.3.5 PGCs的傳代
        4.3.6 PGCs的冷凍保存
        4.3.7 PGCs的復(fù)蘇
        4.3.8 PGCs的鑒定
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 兩種不同來源PGCs的分離培養(yǎng)
        4.4.2 兩種不同來源PGCs的克隆形成能力
        4.4.3 不同培養(yǎng)體系對雞PGCs增殖能力的影響
        4.4.4 PGCs的冷凍保存
        4.4.5 PGCs生物學(xué)特性鑒定
    4.5 討論
        4.5.1 雞PGCs的分離培養(yǎng)
        4.5.2 雞PGCs體外長期培養(yǎng)的難點
    4.6 小結(jié)
第五章 雞卵清蛋白啟動子的功能驗證
    5.1 引言
    5.2 材料與試劑
        5.2.1 主要試劑
        5.2.2 主要儀器
        5.2.3 有關(guān)溶液配制
    5.3 實驗方法
        5.3.1 慢病毒的包裝
        5.3.2 雞輸卵管上皮細胞(OECs)的分離
        5.3.3 慢病毒體外感染雞OECs及 PGCs
        5.3.4 體外感染后外源基因表達情況檢測
        5.3.5 慢病毒體內(nèi)注射
        5.3.6 外源基因表達檢測
    5.4 實驗結(jié)果
        5.4.1 LaSRT法測定病毒滴度
        5.4.2 OECs細胞分離培養(yǎng)
        5.4.3 cERE-cOVP-2785 體外功能驗證
        5.4.4 cERE-cOVP-2785 體內(nèi)功能驗證
    5.5 討論
    5.6 小結(jié)
全文結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況



本文編號：3739464