1、本項研究所采用的青蟹樣本是成熟青蟹卵巢,抱卵蟹上采集的各期青蟹胚胎樣品,以及孵化后的幼體,包括胚胎階段的各期（Eml胚胎期、Em2胚胎期、Em3胚胎期、Em4胚胎期和Em5胚胎期）、幼體各期（溞狀Ⅰ期、搔狀Ⅱ期、溞狀Ⅲ期、溞狀Ⅳ期、溞狀Ⅴ期、大眼幼體和仔蟹Ⅰ期）。對溞狀Ⅰ期、大眼幼體和仔蟹Ⅰ期進行了 LPS刺激和解藻弧菌感染的研究,并采集樣品。2、本研究首先利用各胚胎發(fā)育期和溞狀幼體Ⅰ期樣本建立了 一個轉(zhuǎn)錄組庫,然后在此轉(zhuǎn)錄組庫的基礎(chǔ)上,通過數(shù)字表達譜技術(shù)對青蟹發(fā)育早期差異表達基因進行了研究,共得到9.42 G數(shù)據(jù)量,其中拼接得到116,370條transcripts及77,643條unigenes。通過NR數(shù)據(jù)庫注釋16,170條基因（占全部注釋基因的20.82%）,PFAM數(shù)據(jù)庫注釋18,556條基因（占全部注釋基因的23.89%）,GO數(shù)據(jù)庫注釋19,164條基因（占全部注釋基因的24.68%）。3、對各胚胎發(fā)育期和溞狀幼體Ⅰ期樣品進行蛋白質(zhì)組測序,利用iTRAQ技術(shù)進行蛋白質(zhì)相對定量,共得到譜圖338,059張,通過Mascot軟件進行分析后,匹配到的譜圖數(shù)量是16,362... 

【文章頁數(shù)】：482 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞中英文對照表
第1章 緒論
    1.1 前言
    1.2 擬穴青蟹早期發(fā)育的研究
        1.2.1 擬穴青蟹胚胎及幼體階段發(fā)育史
        1.2.2 擬穴青蟹早期發(fā)育過程中重要的生物學(xué)過程
        1.2.3 擬穴青蟹胚胎及幼體階段研究進展
    1.3 甲殼動物先天性免疫
        1.3.1 模式識別受體PRRs
        1.3.2 抗菌肽
        1.3.3 Toll通路
        1.3.4 IMD通路
        1.3.5 Jak/Stat 通路
        1.3.6 酚氧化酶原系統(tǒng)
        1.3.7 補體系統(tǒng)
        1.3.8 凝血系統(tǒng)
    1.4 組學(xué)在甲殼動物中的研究進展
        1.4.1 轉(zhuǎn)錄組介紹
        1.4.2 蟹類轉(zhuǎn)錄組的研究
        1.4.3 海洋動物不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組研究
        1.4.4 蛋白質(zhì)組介紹
        1.4.5 蟹類蛋白質(zhì)組的研究
        1.4.6 海洋動物不同發(fā)育時期的蛋白質(zhì)組研究
    1.5 研究技術(shù)路線、目的和意義
        1.5.1 研究目的和意義
        1.5.2 研究技術(shù)路線
第2章 擬穴青蟹胚胎各發(fā)育時期和幼體各發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組測序及分析
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 擬穴青蟹人工繁育及胚胎幼體樣品采集
        2.2.2 不同發(fā)育時期的顯微鏡觀察
        2.2.3 總RNA提取
        2.2.4 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建
        2.2.5 測序及拼接
        2.2.6 差異基因表達量分析及基因功能注釋和分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 實驗樣品
        2.3.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)建庫、拼接及注釋
        2.3.3 qPCR驗證
        2.3.4 轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果
    2.4 討論
        2.4.1 擬穴青蟹胚胎至仔蟹Ⅰ期不同發(fā)育階段先天性免疫的基礎(chǔ)研究
        2.4.2 青蟹胚胎和幼體發(fā)育階段高表達的基因
        2.4.3 青蟹潛在的母源因子
        2.4.4 青蟹溞狀幼體孵出過程中的免疫相關(guān)基因變化特點
        2.4.5 自然狀態(tài)下的青蟹早期各發(fā)育階段中抗菌肽表達情況
        2.4.6 自然狀態(tài)下青蟹早期各發(fā)育階段中Toll信號通路和IMD通路的表達情況
        2.4.7 自然狀態(tài)下青蟹早期各發(fā)育階段中酚氧化酶原系統(tǒng)的表達情況
        2.4.8 自然狀態(tài)下青蟹早期各發(fā)育階段中激素的表達情況
        2.4.9 小結(jié)
第3章 擬穴青蟹胚胎發(fā)育時期和幼體發(fā)育時期的蛋白質(zhì)組測序及分析
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗動物
    3.2 實驗方法
        3.2.1 擬穴青蟹人工繁育及胚胎幼體樣品采集
        3.2.2 iTRAQ實驗方法
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)建庫
        3.3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)注釋
        3.3.3 差異蛋白的篩選
        3.3.4 差異蛋白的富集分析
        3.3.5 免疫相關(guān)差異蛋白分析
        3.3.6 蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組的關(guān)聯(lián)分析
    3.4 討論
        3.4.1 青蟹蛋白質(zhì)組學(xué)研究的局限性
        3.4.2 青蟹早期發(fā)育關(guān)鍵階段的差異蛋白
        3.4.3 青蟹胚胎早期發(fā)育階段Em1至Em2期差異表達的免疫相關(guān)蛋白
        3.4.4 青蟹孵化為溞狀幼體階段差異表達的免疫相關(guān)蛋白
        3.4.5 青蟹胚胎發(fā)育階段差異表達的酚氧化酶原系統(tǒng)相關(guān)蛋白
        3.4.6 青蟹胚胎發(fā)育期的蛋白質(zhì)組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的相關(guān)性分析
第4章 LPS刺激和解藻弧菌感染下擬穴青蟹溞狀幼體Ⅰ期、大眼幼體和仔蟹Ⅰ期的轉(zhuǎn)錄組分析及其相關(guān)免疫因子特性分析
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗動物
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 青蟹幼體的解藻弧菌或LPS攻毒試驗
        4.2.2 總RNA提取
        4.2.3 文庫構(gòu)建
        4.2.4 測序及拼接
        4.2.5 基因功能注釋及分析
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 溞狀幼體Ⅰ期、大眼幼體和仔蟹Ⅰ期LPS刺激或解藻弧菌感染樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量分析
        4.3.2 溞狀幼體Ⅰ期LPS刺激或解藻弧菌感染樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
        4.3.3 大眼幼體LPS刺激或解藻弧菌感染樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
        4.3.4 仔蟹Ⅰ期LPS刺激或解藻弧菌感染樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
    4.4 討論
        4.4.1 解藻弧菌感染下溞狀幼體Ⅰ期、大眼幼體及仔蟹Ⅰ期的轉(zhuǎn)錄組分析
        4.4.2 LPS下溞狀幼體Ⅰ期、大眼幼體及仔蟹Ⅰ期的轉(zhuǎn)錄組分析
        4.4.3 LPS和解藻弧菌感染下溞狀幼體Ⅰ期、大眼幼體及仔蟹Ⅰ期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的比較研究
        4.4.4 病原感染下溞狀幼體Ⅰ期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
        4.4.5 病原感染下大眼幼體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
        4.4.6 病原感染下仔蟹Ⅰ期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
第5章 模式識別受體SpLGBP的分子基礎(chǔ)研究
    5.1 實驗材料
        5.1.1 實驗動物和菌株
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 主要儀器
        5.1.4 主要溶液配制
    5.2 實驗方法
        5.2.1 引物設(shè)計
        5.2.2 青蟹細菌或LPS感染試驗
        5.2.3 青蟹組織的采集
        5.2.4 生物信息學(xué)分析
        5.2.5 總RNA的提取
        5.2.6 cDNA的合成
        5.2.7 SpLGBP構(gòu)建載體所需的目的基因片段的獲得
        5.2.8 SpLGBP蛋白的原核表達與純化
        5.2.9 細菌凝集實驗
        5.2.10 糖類結(jié)合實驗
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 序列擴增和分析
        5.3.2 氨基酸序列生物信息學(xué)分析及同源性分析
        5.3.3 自然狀態(tài)下青蟹SpLGBP在不同組織器官中的表達情況
        5.3.4 SpLGBP轉(zhuǎn)錄本在早期發(fā)育階段的表達情況
        5.3.5 LPS或解藻弧菌感染后SpLGBP轉(zhuǎn)錄本在溞狀幼體Ⅰ期、大眼幼體和仔蟹Ⅰ期中的表達情況
        5.3.6 LPS或副溶血弧菌感染下,血淋巴細胞和肝胰腺中SpLGBP基因的表達情況
        5.3.7 SpLGBP重組質(zhì)粒構(gòu)建
        5.3.8 SpLGBP的誘導(dǎo)表達
        5.3.9 SpLGBP蛋白的分離純化
        5.3.10 BCA法測定目的蛋白的濃度
        5.3.11 細菌凝集實驗
        5.3.12 糖類結(jié)合實驗
    5.4 討論
參考文獻
結(jié)語
在學(xué)期間參加的科研項目及成果
致謝



本文編號：3733798