番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus,ToCV）為長(zhǎng)線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus）病毒,自2013年在我國(guó)山東爆發(fā),現(xiàn)呈全國(guó)擴(kuò)散趨勢(shì),嚴(yán)重威脅我國(guó)番茄等茄科重要經(jīng)濟(jì)作物的安全生產(chǎn)。加強(qiáng)該病毒的快速檢測(cè)技術(shù)體系,病毒與寄主互作的分子機(jī)制等研究,可明確該病毒在我國(guó)的擴(kuò)散分布,分析其對(duì)番茄等重要經(jīng)濟(jì)作物的潛在威脅,也可為該病毒病的科學(xué)防控提供技術(shù)手段和科學(xué)依據(jù)。利用原核表達(dá)的ToCV CP及HSP70蛋白作為抗原,制備獲得CP蛋白和HSP70蛋白的多克隆抗體,稀釋10,000倍,可特異性識(shí)別相應(yīng)的抗原,為開發(fā)ToCV快速檢測(cè)技術(shù)提供了技術(shù)資源。采用無(wú)縫克隆技術(shù),構(gòu)建了ToCV全長(zhǎng)基因組cDNA侵染性克隆,利用農(nóng)桿菌接種本氏煙BY2細(xì)胞和番茄,均接種不成功;農(nóng)桿菌介導(dǎo)法接種本氏煙,接種成功率為15%。采用基因槍法,ToCV侵染性克隆質(zhì)粒接種本氏煙和番茄,也均接種失敗;利用PEG介導(dǎo)法接種本氏煙BY2細(xì)胞,ToCV侵染率可達(dá)60%。利用粉虱接種ToCV至番茄,采用相對(duì)定量技術(shù)測(cè)定接種病毒后番茄各部位的感病時(shí)間及病毒含量,結(jié)果表... 

【文章頁(yè)數(shù)】：98 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 番茄褪綠病毒
        1.1.1 病毒簡(jiǎn)介
        1.1.2 番茄褪綠病毒主要基因及其功能簡(jiǎn)介
        1.1.3 番茄褪綠病毒檢測(cè)技術(shù)
        1.1.4 番茄褪綠病毒病主要防控技術(shù)
    1.2 細(xì)胞自噬
        1.2.1 細(xì)胞自噬的形式及過(guò)程
        1.2.2 細(xì)胞自噬的分子機(jī)制
        1.2.3 細(xì)胞自噬的研究方法
        1.2.4 細(xì)胞自噬在抗病毒反應(yīng)中的作用
        1.2.5 細(xì)胞自噬防御病毒侵染的機(jī)制
        1.2.6 病毒逃避被細(xì)胞自噬降解的分子機(jī)制
    1.3 構(gòu)建植物病毒侵染性克隆的方法及意義
        1.3.1 侵染性克隆的種類及特點(diǎn)
        1.3.2 構(gòu)建侵染性克隆的方法
        1.3.3 侵染性克隆在植物病毒研究中的應(yīng)用
    1.4 酵母雙雜交技術(shù)原理以及在植物病毒研究中的應(yīng)用
        1.4.1 酵母雙雜交的原理
        1.4.2 酵母雙雜交技術(shù)的優(yōu)劣
        1.4.3 酵母雙雜交系統(tǒng)在植物病毒研究中的應(yīng)用
    1.5 本研究的目的和意義
第二章 番茄褪綠病毒CP及 HSP70 蛋白多克隆抗體制備
    2.1 材料與方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 Trizol提取番茄葉片總RNA
        2.1.3 RT-PCR擴(kuò)增目的片段
        2.1.4 大腸桿菌DH5α及 BL21 感受態(tài)的制備
        2.1.5 原核表達(dá)載體構(gòu)建
        2.1.6 CP及 HSP70 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        2.1.7 SDS-PAGE電泳
        2.1.8 CP蛋白及HSP70 蛋白多克隆抗體制備及檢測(cè)
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 番茄褪綠病毒CP及 HSP70 基因的擴(kuò)增
        2.2.2 目的基因連接克隆載體并測(cè)序
        2.2.3 目的片段連接原核表達(dá)載體
        2.2.4 陽(yáng)性克隆的PCR鑒定
        2.2.5 CP及 HSP70 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        2.2.6 CP多克隆抗體檢測(cè)
        2.2.7 HSP70 多克隆抗體檢測(cè)
    2.3 小結(jié)與討論
第三章 番茄褪綠病毒c DNA侵染性克隆構(gòu)建
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 番茄褪綠病毒全基因組擴(kuò)增
        3.1.3 同源重組構(gòu)建侵染性克隆
        3.1.4 ToCV全基因組融合植物表達(dá)載體pCB-301-CH策略
        3.1.5 利用農(nóng)桿菌接種番茄褪綠病毒侵染性克隆
        3.1.6 番茄褪綠病毒侵染性克隆接種BY2 細(xì)胞
        3.1.7 利用基因槍接種本氏煙及番茄
        3.1.8 dot-ELISA檢測(cè)番茄褪綠病毒
        3.1.9 RT-PCR檢測(cè)番茄褪綠病毒
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 番茄褪綠病毒基因組全長(zhǎng)擴(kuò)增
        3.2.2 獲得的番茄褪綠病毒基因組片段連接克隆載體
        3.2.3 植物表達(dá)載體和目的片段線性化
        3.2.4 同源重組融合RNA11-4kb及 RNA21-4kb至載體
        3.2.5 pCB-RNA1 1-4 kbp、pCB-RNA2 1-4 kbp質(zhì)粒線性化及 RNA1 4-8 kbp、RNA2 4-8 kbp 片段擴(kuò)增
        3.2.6 番茄褪綠病毒侵染性克隆載體構(gòu)建
        3.2.7 農(nóng)桿菌接種番茄褪綠病毒侵染性克隆
        3.2.8 番茄褪綠病毒侵染性克隆接種BY2 細(xì)胞
        3.2.9 基因槍接種番茄褪綠病毒侵染性克隆
    3.3 小結(jié)與討論
第四章 番茄褪綠病毒激活番茄自噬體途徑促進(jìn)病毒復(fù)制
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 MDC染色觀察葉片中自噬小泡數(shù)量
        4.1.3 Western Blotting檢測(cè)LC3II/I蛋白的含量
        4.1.4 細(xì)胞自噬激活/抑制劑處理番茄后對(duì)葉片中ToCV病毒含量的影響
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 MDC染色觀察BY2 細(xì)胞及番茄葉片中自噬小泡數(shù)量
        4.2.2 Western Blotting檢測(cè)LC3II/LC3I蛋白含量
        4.2.3 細(xì)胞自噬體途徑對(duì)ToCV病毒復(fù)制的影響
    4.3 小結(jié)與討論
第五章 番茄褪綠病毒衣殼蛋白CP/CPm與自噬蛋白互作
    5.1 材料與方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 番茄接種番茄褪綠病毒的發(fā)病時(shí)間及病毒在寄主中的擴(kuò)散趨勢(shì)
        5.1.3 番茄感染番茄褪綠病毒后ATG相關(guān)基因的熒光定量分析
        5.1.4 同源重組構(gòu)建番茄褪綠病毒CP、CPm及番茄ATG蛋白酵母表達(dá)載體
        5.1.5 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)
        5.1.6 CP及 CPm蛋白互作結(jié)構(gòu)域篩選
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 番茄褪綠病毒在寄主中的擴(kuò)散趨勢(shì)
        5.2.2 自噬相關(guān)基因表達(dá)量分析
        5.2.3 無(wú)縫克隆技術(shù)構(gòu)建酵母表達(dá)載體
        5.2.4 酵母雙雜技術(shù)篩選與CP或 CPm互作的寄主靶標(biāo)蛋白
        5.2.5 CP或 CPm與寄主蛋白的互作結(jié)構(gòu)域篩選
    5.3 小結(jié)與討論
結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
附錄 A 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄
附錄 B 主要試劑的配方
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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