miR-302家族是胚胎干細(xì)胞（ESC）特異性的miRNA家族。研究發(fā)現(xiàn)miR-302s作為增強(qiáng)子可以提高體細(xì)胞重編程（SCR）效率,其單獨(dú)使用可以獲得人和小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（i PSC）。目前對(duì)大家畜miR-302家族的序列和功能研究報(bào)道較少,僅有miR-302s促進(jìn)SCR的研究。為了探討miR-302家族在大家畜SCR過(guò)程中的功能及作用機(jī)制,本研究克隆了水牛miR-302s序列,并構(gòu)建真核表達(dá)載體,將其應(yīng)用于重編程巴馬豬成纖維細(xì)胞（PFF）為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞,重點(diǎn)探討了四轉(zhuǎn)錄因子（OSKM）與miR-302s兩種方法誘導(dǎo)PFF為多能干細(xì)胞進(jìn)程中的細(xì)胞轉(zhuǎn)變過(guò)程及相關(guān)基因表達(dá)的差異。研究結(jié)果如下:1.水牛miR-302s真核表達(dá)載體的構(gòu)建克隆并構(gòu)建了水牛miR-302s的慢病毒表達(dá)載體（bbu-miR-302s）,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。測(cè)序結(jié)果顯示,擴(kuò)增獲得的是水牛miR-302家族序列,其位于水牛7號(hào)染色體LARP7基因的內(nèi)含子區(qū)域。miR-302家族成員之間以及miR-302家族在不同物種間均高度保守。預(yù)測(cè)水牛miR-302s主要靶基因共有255個(gè),這些靶基因主要集中在33個(gè)通路中,... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞研究進(jìn)展
        1.1 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞
        1.2 影響誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的因素
            1.2.1 基因傳遞方式
            1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)條件
            1.2.3 供體細(xì)胞來(lái)源
            1.2.4 轉(zhuǎn)錄因子的選擇
        1.3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞重編程的機(jī)理
        1.4 有蹄類家畜iPSC的研究進(jìn)展
        1.5 iPSC與疾病模型
        1.6 iPSC與動(dòng)物轉(zhuǎn)基因工程
        1.7 大家畜iPSC存在的問(wèn)題及前景展望
    2 miR-302s研究進(jìn)展
        2.1 miR-302s的發(fā)現(xiàn)及作用機(jī)制
        2.2 miR-302s對(duì)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的作用
            2.2.1 miR-302s與DNA甲基化
            2.2.2 miR-302s與多能基因的表達(dá)
            2.2.3 miR-302s抑制細(xì)胞分化
            2.2.4 miR-302s抑制干細(xì)胞致瘤性
        2.3 miR-302s誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究進(jìn)展
    3 本研究目的與意義
第二章 水牛miR-302s載體構(gòu)建及生物信息學(xué)分析
    摘要
    前言
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料
        1.2 主要試劑與設(shè)備
            1.2.1 主要試劑
            1.2.2 主要儀器設(shè)備
            1.2.3 主要溶液配制
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 卵巢組織基因組的提取
            1.3.2 水牛miR-302s前體序列擴(kuò)增
            1.3.3 目的片段純化及T-A克隆
            1.3.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
            1.3.5 bbu-miR-302s真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
            1.3.6 miR-302家族生物信息學(xué)分析
            1.3.7 數(shù)據(jù)庫(kù)和分析軟件
            1.3.8 細(xì)胞培養(yǎng)
            1.3.9 慢病毒包裝及滴度測(cè)定
    2 結(jié)果
        2.1 水牛miR-302s真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2 水牛miR-302s慢病毒真核載體的有效性檢測(cè)
        2.3 bbu-mi R-302s基因家族生物信息學(xué)分析
            2.3.1 miR-302s基因家族序列及其在基因組中的定位
            2.3.2 bbu-miR-302s基因家族保守性及進(jìn)化樹(shù)分析
            2.3.3 miR-302s靶基因預(yù)測(cè)及生物信息學(xué)分析
    3 討論
    4 小結(jié)
第三章 miR-302s重編程巴馬香豬體細(xì)胞為多能干細(xì)胞的初步研究
    摘要
    前言
    1 材料與方法
        1.1 材料和試劑
            1.1.1 細(xì)胞
            1.1.2 質(zhì)粒和菌種
        1.2 主要試劑與設(shè)備
            1.2.1 主要試劑
            1.2.2 主要儀器
            1.2.3 主要試劑配制
            1.2.4 引物設(shè)計(jì)及合成
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 質(zhì)粒提取
            1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)
            1.3.3 慢病毒包裝及滴度測(cè)定
            1.3.4 病毒感染及誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)
            1.3.5 重編程效率檢測(cè)
            1.3.6 piPSC的傳代培養(yǎng)
            1.3.7 piPSC多能性基因以及三胚層基因檢測(cè)
            1.3.8 免疫細(xì)胞熒光
            1.3.9 細(xì)胞增殖檢測(cè)
            1.3.10 核型分析
            1.3.11 擬胚體實(shí)驗(yàn)
            1.3.12 統(tǒng)計(jì)分析
    2 結(jié)果
        2.1 質(zhì)粒提取及鑒定
        2.2 miR-302s重編程巴馬香豬成纖維細(xì)胞為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究
        2.3 miR-302s-piPSC多能性檢測(cè)
        2.4 miR-302s-piPSC體外分化能力檢測(cè)
        2.5 miR-302s-piPSC細(xì)胞倍增時(shí)間和核型分析
        2.6 miR-302s-piPSC與OSKM-piPSC的比較分析
            2.6.1 傳統(tǒng)四因子(OSKM)重編程巴馬香豬成纖維細(xì)胞為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞
            2.6.2 OSKM-piPSC與miR-302s-piPSC多能性比較
            2.6.3 OSKM-piPSC與miR-302s-piPSC倍增時(shí)間比較
            2.6.4 OSKM-piPSC與miR-302s-piPSC重編程效率和多能基因表達(dá)量的比較研究
            2.6.5 OSKM-piPSC與miR-302s-piPSC繼代培養(yǎng)能力的比較
    3 討論
    4 小結(jié)
第四章 miR-302s重編程巴馬豬成纖維細(xì)胞過(guò)程中間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化的研究
    摘要
    前言
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料
        1.2 主要試劑及設(shè)備
            1.2.1 主要儀器
            1.2.2 主要試劑配制
            1.2.3 引物設(shè)計(jì)及合成
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 細(xì)胞粘附測(cè)定
            1.3.2 免疫熒光檢測(cè)肌纖維
            1.3.3 QRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)變化
            1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析
    2 結(jié)果
        2.1 miR-302s對(duì)巴馬香豬成纖維細(xì)胞重編程進(jìn)程中粘附能力的檢測(cè)
        2.2 miR-302s對(duì)巴馬香豬成纖維細(xì)胞重編程進(jìn)程中應(yīng)力纖維的影響
        2.3 miR-302s對(duì)巴馬香豬體細(xì)胞重編程進(jìn)程中MET/EMT分子標(biāo)記基因的影響
        2.4 miR-302s與OSKM重編程進(jìn)程中MET/EMT的比較分析
    3 討論
    4 小結(jié)
第五章 不同重編程因子miR-302s與OSKM在巴馬豬成纖維細(xì)胞重編程過(guò)程中差異表達(dá)基因的比較研究
    摘要
    前言
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料
        1.2 主要試劑及設(shè)備
            1.2.1 主要試劑
            1.2.2 主要儀器
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 不同重編程因子誘導(dǎo)巴馬香豬成纖維細(xì)胞的制備
            1.3.2 RNA提取及質(zhì)檢
            1.3.3 文庫(kù)構(gòu)建
            1.3.4 上機(jī)檢測(cè)
            1.3.5 測(cè)序原始數(shù)據(jù)質(zhì)控及生物信息學(xué)分析
    2 結(jié)果
        2.1 總RNA的提取和質(zhì)量檢測(cè)
        2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估
            2.2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序原始數(shù)據(jù)評(píng)估
            2.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)在參考基因組定位分析
            2.2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)的飽和度和Reads覆蓋度
            2.2.4 樣品間相關(guān)性分析
        2.3 差異表達(dá)基因分析
            2.3.1 不同重編程因子對(duì)巴馬香豬重編程過(guò)程中差異基因的比較研究
            2.3.2 重編程因子OSKM與miR-302s對(duì)巴馬香豬重編程過(guò)程中作用機(jī)制的研究
    3 討論
    4 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄 中英文縮略詞表
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況



本文編號(hào)：3685990