發(fā)布時間：2022-10-04 19:54

　　豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的病原是PRRS病毒（PRRSV）,是一種危害嚴(yán)重的病毒性疫病,給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白9（Non-structural protein 9,Nsp9）有RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp）功能,對病毒復(fù)制至關(guān)重要。另外,Nsp9序列相對保守,是理想的抗PRRSV靶標(biāo)。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)在MARC-145細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)Nsp9特異性納米抗體Nb6能抑制PRRSV復(fù)制。同時,還證明了Nb6與細(xì)胞穿膜肽（Cell penetrating peptide,CPP）融合表達(dá)的重組蛋白能進(jìn)入宿主細(xì)胞并發(fā)揮抗病毒功能。然而,Nb6通過靶向Nsp9抑制PRRSV復(fù)制的抗病毒機制尚不清楚,此外,Nsp9的三維結(jié)構(gòu)未知。本研究使用X-射線小角散射（Small-angle X-ray scattering,SAXS）技術(shù),獲得了Nsp9以及Nsp9-Nb6復(fù)合物的分子包膜信息,同時鑒定了參與Nsp9-Nb6相互作用的重要氨基酸位點。在此基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步通過反向遺傳技術(shù)構(gòu)建了突變這些氨基... 

【文章頁數(shù)】：143 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號對照表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒的研究進(jìn)展
        1.1.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒概況
        1.1.2 PRRSV基因組構(gòu)成
        1.1.3 PRRSV感染有關(guān)的細(xì)胞的受體及因子
        1.1.4 PRRSV致病的分子機制
    1.2 PRRSV Nsp9概述
    1.3 PRRSV防控策略
        1.3.1 PRRSV入侵阻斷劑
        1.3.2 PRRSV感染過程中宿主miRNAs的抗病毒作用
        1.3.3 基于反義RNA的策略作為PRRSV特異性療法
        1.3.4 草藥提取物和化合物抑制PRRSV
        1.3.5 抗PRRSV的納米抗體
        1.3.6 免疫刺激劑及其作為PRRSV疫苗佐劑的潛力
        1.3.7 當(dāng)前的挑戰(zhàn)和未來的研究方向
    1.4 X-射線小角散射概述
        1.4.1 SAXS在結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用
        1.4.2 展望
    1.5 本研究的目的和意義
第二章 PRRSV Nsp9的生物學(xué)結(jié)構(gòu)研究
    2.1 材料
        2.1.1 質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑和耗材
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 主要試劑配制
    2.2 方法
        2.2.1 Nsp9重組蛋白的表達(dá)純化
        2.2.2 Nsp9重組蛋白的晶體生長
        2.2.3 Nsp9重組蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測
        2.2.4 Nsp9截短片段的擴增以及原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.5 分析Nsp9截短蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)
        2.2.6 測量Nsp9重組蛋白的粒徑大小
        2.2.7 Nsp9 重組蛋白SAXS分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 Nsp9重組蛋白的純化
        2.3.2 Nsp9重組蛋白預(yù)測的結(jié)構(gòu)
        2.3.3 Nsp9截短片段原核表達(dá)載體的構(gòu)建以及表達(dá)
        2.3.4 Nsp9重組蛋白DLS分析
        2.3.5 Nsp9SAXS分析
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 Nsp9 特異的納米抗體Nb6和Nb7的生物學(xué)結(jié)構(gòu)研究
    3.1 材料
        3.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞
        3.1.2 主要試劑和耗材
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 主要試劑配制
    3.2 方法
        3.2.1 基因擴增及表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.2 Nb6/Nb7重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)與純化
        3.2.3 Nb6/Nb7重組蛋白在巴斯德畢氏酵母X-33中的克隆、表達(dá)和純化
        3.2.4 在酵母中表達(dá)的Nb6/Nb7重組蛋白的晶體生長
        3.2.5 Nb7重組蛋白晶體數(shù)據(jù)收集與處理
        3.2.6 解析Nb7重組蛋白的晶體結(jié)構(gòu)
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 pMECS-Nb6/Nb7原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.2 Nb6/Nb7重組蛋白在大腸桿菌中周質(zhì)中的表達(dá)及純化
        3.3.3 pPICZαA-Nb6/Nb7重組表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.4 Nb6/Nb7重組蛋白在酵母中的表達(dá)分析
        3.3.5 Nb6/Nb7重組蛋白的純化
        3.3.6 Nb6/Nb7重組蛋白結(jié)晶及條件優(yōu)化
        3.3.7 Nb7重組蛋白的晶體數(shù)據(jù)收集、處理及結(jié)構(gòu)解析
        3.3.8 Nb7重組蛋白晶體結(jié)構(gòu)
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 Nsp9 上影響PRRSV復(fù)制關(guān)鍵氨基酸位點分析
    4.1 材料
        4.1.1 主要試劑耗材
        4.1.2 主要儀器設(shè)備
    4.2 方法
        4.2.1 BLI分析Nsp9重組蛋白與Nb6之間的親和力大小
        4.2.2 Nsp9-Nb6復(fù)合物的純化
        4.2.3 測量Nsp9-Nb6復(fù)合物的粒徑大小
        4.2.4 Nsp9-Nb6復(fù)合物蛋白晶體生長條件篩選
        4.2.5 Nsp9-Nb6 復(fù)合物SAXS分析
        4.2.6 Nb6突變體蛋白的表達(dá)和純化
        4.2.7 Nsp9突變體蛋白的表達(dá)和純化
        4.2.8 Nb6突變體蛋白與Nsp9之間的親和力測定
        4.2.9 Nsp9突變體蛋白與Nb6之間的親和力測定
        4.2.10 突變病毒的構(gòu)建及鑒定
        4.2.11 突變病毒的拯救
        4.2.12 拯救病毒的鑒定
        4.2.13 重組病毒的病毒滴度測定
        4.2.14 重組病毒的增殖特性分析
        4.2.15 Nsp9上的氨基酸替換對病毒RNA相對水平的影響
        4.2.16 Nsp9上的氨基酸替換對病毒負(fù)鏈基因組RNA水平的影響
        4.2.17 Nsp9上的氨基酸替換對病毒感染水平的影響
        4.2.18 對PRRSV Nsp9中氨基酸殘基561-689進(jìn)行序列比對
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 Nb6和Nsp9之間親和力的測定
        4.3.2 Nb6與Nsp9復(fù)合物的純化
        4.3.3 DLS檢測分析
        4.3.4 Nsp9-Nb6復(fù)合物SAXS分析
        4.3.5 Nsp9-Nb6復(fù)合物相互作用位點分析
        4.3.6 突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.7 突變病毒的拯救
        4.3.8 拯救病毒的核酸檢測
        4.3.9 Nsp9上參與病毒復(fù)制的關(guān)鍵氨基酸位點鑒定
        4.3.10 病毒感染能力檢測
        4.3.11 I588、L643在Nsp9的保守性分析
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
個人簡歷



本文編號：3685660