我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)中普遍存在抗生素濫用的問題,抗生素濫用往往會催生多重耐藥細菌,對公共衛(wèi)生安全造成威脅。其中,因感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus,MRSA）而導(dǎo)致的奶牛乳房炎,往往給奶牛健康和奶業(yè)生產(chǎn)造成嚴重威脅。治療MRSA所導(dǎo)致的感染往往有以下兩個難點:（1）MRSA可能帶有多重耐藥基因,對多種抗生素具有耐藥性,限制了可治療藥物的選擇;（2）金黃色葡萄球菌可粘附并侵入宿主細胞內(nèi),從而逃避了宿主擊殺和抗生素的作用。為了解陜西地區(qū)多重耐藥的葡萄球菌流行狀況,為指導(dǎo)陜西地區(qū)奶牛的健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)和參考,本課題組在陜西本地三家不同規(guī)模的奶牛養(yǎng)殖場中,選取了53頭疑似患有奶牛乳房炎的奶牛,共采集得到了200份牛奶樣品,從這些樣品中,分離得到了144株葡萄球菌（吳兆韡,2018）。在此基礎(chǔ)上,對這144株葡萄球菌進行了4種畜牧生產(chǎn)中常用抗生素（頭孢唑林、替考拉寧、環(huán)丙沙星和氯霉素）的耐藥檢測試驗。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):144株葡萄球菌中,7.6%的菌株對替考拉寧耐藥,14.6%的菌株對頭孢唑林耐藥,50%的菌株對環(huán)丙沙... 

【文章頁數(shù)】：116 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 奶牛健康養(yǎng)殖
    1.2 抗生素對奶牛養(yǎng)殖的潛在危害
    1.3 奶牛乳房炎
        1.3.1 奶牛乳房炎的類型及診斷
        1.3.2 奶牛乳房炎的危害
    1.4 引起奶牛乳房炎的主要病原菌
        1.4.1 金黃色葡萄球菌
        1.4.2 鏈球菌屬
        1.4.3 大腸桿菌
        1.4.4 血漿凝固酶陰性的葡萄球菌
    1.5 金黃色葡萄球菌的耐藥性
        1.5.1 青霉素和甲氧西林的耐藥性
        1.5.2 針對PBP2a的新型β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性
        1.5.3 萬古霉素的耐藥性
    1.6 金黃色葡萄球菌的細胞壁
        1.6.1 肽聚糖
        1.6.2 壁磷壁酸
        1.6.3 莢膜多糖
        1.6.4 表面蛋白
    1.7 Lyt R-Cps A-Psr家族蛋白
    1.8 利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對金黃色葡萄球菌基因敲除
    1.9 本研究的目的和意義及主要研究內(nèi)容
        1.9.1 研究目的和意義
        1.9.2 主要研究內(nèi)容
試驗部分
    第二章 奶牛乳房炎來源的葡萄球菌的抗性檢測
        2.1 實驗材料
            2.1.1 試劑
            2.1.2 主要儀器設(shè)備
        2.2 試驗方法
            2.2.1 Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基
            2.2.2 瓊脂稀釋法平板的準備
            2.2.3 菌液的準備與處理
            2.2.4 瓊脂稀釋法平板的接種和培養(yǎng)
            2.2.5 MIC的讀取
            2.2.6 耐藥菌株的各抗性示意圖
        2.3 試驗結(jié)果
        2.4 討論
        2.5 小結(jié)
    第三章 奶牛乳腺來源的MRSA中與耐藥有關(guān)基因的敲除體構(gòu)建及相關(guān)表型的檢測
        3.1 試驗材料
            3.1.1 菌株
            3.1.2 質(zhì)粒
            3.1.3 引物及序列信息
            3.1.4 試劑
            3.1.5 主要儀器及設(shè)備
        3.2 試驗原理及方法
            3.2.1 CRISPR-Cas9 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.2.2 構(gòu)建過表達載體pSE1-16
            3.2.3 金黃色葡萄球菌的電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞的制備及電轉(zhuǎn)化
            3.2.4 構(gòu)建敲除菌株
        3.3 相關(guān)表型檢測
            3.3.1 菌株耐藥性的檢測
            3.3.2 金黃色葡萄球菌生物膜形成能力的檢測
            3.3.3 統(tǒng)計分析方法
        3.4 結(jié)果
            3.4.1 金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)錄因子敲除體庫的構(gòu)建
            3.4.2 金黃色葡萄球菌敲除體的表型檢測
            3.4.3 回補敲除基因抗性表型恢復(fù)
        3.5 討論
        3.6 小結(jié)
    第四章 細胞壁連接酶Lcp C影響MRSA耐藥性及致病性的研究
        4.1 試驗材料
            4.1.1 菌株
            4.1.2 質(zhì)粒
            4.1.3 引物及測序服務(wù)
            4.1.4 細胞系
            4.1.5 試劑
            4.1.6 主要儀器及設(shè)備
        4.2 試驗原理及方法
            4.2.1 構(gòu)建LcpC敲除菌株
            4.2.2 構(gòu)建LcpC基因的原位回補菌株
            4.2.3 LcpC蛋白純化及其多克隆抗體的制備與純化
            4.2.4 LcpC敲除菌株耐藥性的檢測
            4.2.5 細胞粘附試驗
            4.2.6 電鏡觀測LcpC敲除菌細胞壁的形態(tài)
            4.2.7 小鼠膿毒血癥模型
            4.2.8 巨噬細胞炎癥因子的檢測
            4.2.9 實時定量PCR試驗
            4.2.10 雙分子熒光互補檢測LcpC與其他蛋白間的相互作用
            4.2.11 統(tǒng)計分析方法
        4.3 試驗結(jié)果
            4.3.1 LcpC菌株的敲除與回補
            4.3.2 LcpC蛋白純化及抗體制備
            4.3.3 LcpC的敲除影響金黃色葡萄球菌對多種抗生素的耐藥性
            4.3.4 LcpC的敲除影響金黃色葡萄球菌對細胞的粘附作用
            4.3.5 LcpC的敲除影響金黃色葡萄球菌的細胞壁形態(tài)
            4.3.6 Lcp C的敲除會降低MRSA對小鼠的致病性
            4.3.7 LcpC的敲除降低巨噬細胞的炎癥因子表達水平
            4.3.8 Lcp C的敲除影響與細胞壁合成有關(guān)基因和細胞表面蛋白的m RNA水平
            4.3.9 熒光雙分子互補試驗驗證與LcpC相互作用的蛋白
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
    第五章 論文總結(jié)
        5.1 結(jié)論
        5.2 創(chuàng)新點
        5.3 研究展望
參考文獻
附錄
致謝
個人簡歷



本文編號：3649351