發(fā)布時(shí)間：2022-04-28 21:29

　　結(jié)核�。═uberculosis）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）引起的一種慢性、消耗性人獸共患傳染病,可通過患者咳嗽或打噴嚏時(shí)形成的帶菌氣溶膠,在人與人、人與動(dòng)物之間傳播。據(jù)報(bào)道,結(jié)核病是全球范圍內(nèi)危害人類健康的十大重要傳染病之一,每年約有一千萬人感染結(jié)核病,造成約一百七十萬人死亡。近些年來,由于多重耐藥結(jié)核分枝桿菌（MDR-TB）及廣譜耐藥結(jié)核分枝桿菌（XDR-TB）的流行及其與HIV病毒的混合感染,使得結(jié)核病的防控變得更加困難。因此,迫切需要我們闡明結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制,尋找結(jié)核病新的藥物作用靶點(diǎn),創(chuàng)制新型疫苗以降低該病給人類健康造成的危害。眾所周知,肺泡巨噬細(xì)胞是MTB主要感染及入侵的靶細(xì)胞,在MTB感染細(xì)胞的過程中,許多毒力因子都發(fā)揮了重要的作用。而絲氨酸蛋白酶類是MTB的一類重要的毒力因子,與菌體對(duì)巨噬細(xì)胞的侵襲以及在巨噬細(xì)胞中的持留密切相關(guān),但該酶類的理化特性及其在致病性方面所扮演的具體作用仍有待進(jìn)一步研究。本研究利用生物信息學(xué)方法,分析了Rv3194c蛋白可能為MTB的一個(gè)潛在的胞外絲氨酸蛋白酶,在大腸桿菌中表達(dá)并純化了結(jié)核分... 

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 結(jié)核分枝桿菌與結(jié)核病的概述
    1.2 結(jié)核病的流行病學(xué)概述
    1.3 結(jié)核病的微生物學(xué)和致病機(jī)制研究
        1.3.1 結(jié)核分枝桿菌和宿主之間的相互作用
        1.3.2 結(jié)核分枝桿菌的毒力研究
        1.3.3 結(jié)核病的免疫學(xué)研究
        1.3.4 肉芽腫的形成
        1.3.5 結(jié)核分枝桿菌的耐藥性研究
    1.4 絲氨酸蛋白酶
        1.4.1 絲氨酸蛋白酶的種類
        1.4.2 絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)
        1.4.3 絲氨酸蛋白酶的功能
    1.5 革蘭氏陰性菌中的絲氨酸蛋白酶
        1.5.1 蛋白酶的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制
        1.5.2 HtrA及 HtrA樣絲氨酸蛋白酶
    1.6 革蘭氏陽性菌中的絲氨酸蛋白酶
    1.7 結(jié)論
    1.8 本研究的目的與意義
第二章 RV3194C蛋白的純化與多克隆抗體的制備
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、載體和菌株
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 引物的設(shè)計(jì)
        2.2.2 結(jié)核分枝桿菌rv3194和rv0983基因的擴(kuò)增
        2.2.3 rv3194和rv0983基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.4 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)與表達(dá)
        2.2.5 Rv3194c和 Rv0983c蛋白的純化
        2.2.6 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜驗(yàn)證
        2.2.7 抗Rv3194c蛋白多克隆抗體的制備
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 目的基因的擴(kuò)增與重組質(zhì)粒雙酶切鑒定
        2.3.2 Rv3194c和 Rv0983c蛋白的表達(dá)
        2.3.3 Rv3194c和 Rv0983c蛋白的純化
        2.3.4 Rv3194c蛋白的Westernblot鑒定
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 結(jié)核分枝桿菌RV3194C絲氨酸蛋白酶活性研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 Rv3194c蛋白酶活性與蛋白酶底物的測(cè)定
        3.2.2 不同pH值及溫度對(duì)Rv3194c酶活性的影響
        3.2.3 不同二價(jià)金屬離子對(duì)Rv3194c酶活性的影響
        3.2.4 Rv3194c蛋白酶活性的動(dòng)力學(xué)研究
        3.2.5 Rv3194c蛋白酶抑制劑的篩選
        3.2.6 Rv3194c蛋白酶活性中心的確定
        3.2.7 圓二色譜分析Rv3194c及其突變體二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 Rv3194c絲氨酸蛋白酶活性的鑒定
        3.3.2 不同pH和溫度對(duì)Rv3194c活性的影響
        3.3.3 不同二價(jià)金屬離子對(duì)Rv3194c活性的影響
        3.3.4 Rv3194c蛋白酶活性的動(dòng)力學(xué)研究
        3.3.5 Rv03194c酶活性抑制劑的篩選
        3.3.6 點(diǎn)突變蛋白的純化與活性測(cè)定
        3.3.7 圓二色譜分析
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 結(jié)核分枝桿菌RV3194C的致病性研究
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞
        4.1.2 菌株和載體
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建
        4.2.2 細(xì)菌組分分離與蛋白的亞細(xì)胞定位
        4.2.3 重組菌生長曲線的測(cè)定及抑菌實(shí)驗(yàn)
        4.2.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
        4.2.5 小鼠感染試驗(yàn)
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 重組恥垢分枝桿菌及BCG中 Rv3194c的定位分析
        4.3.2 重組菌生長曲線的測(cè)定及樺木酸體外抑菌實(shí)驗(yàn)
        4.3.3 Rv3194c抑制巨噬細(xì)胞遷徙、吞噬和趨化作用
        4.3.4 重組菌在小鼠肺內(nèi)的定殖能力及肺臟病理檢測(cè)
        4.3.5 Rv3194c上調(diào)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]絲氨酸蛋白酶研究進(jìn)展[J]. 汪世華,王文勇,黃益洲,林琳,沙莉.  福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2007(04)
[2]基于結(jié)構(gòu)的絲氨酸蛋白酶超家族進(jìn)化分析[J]. 季星來,孫之榮.  電子學(xué)報(bào). 2001(S1)
[3]絲氨酸蛋白酶超家族分子結(jié)構(gòu)進(jìn)化研究[J]. 孫之榮,王鈺,胡勝民,郭青,賀福初.  生物物理學(xué)報(bào). 1999(03)
[4]絲氨酸蛋白酶的蛋白質(zhì)工程[J]. 張龍翔.  生命的化學(xué)(中國生物化學(xué)會(huì)通訊). 1992(02)



本文編號(hào)：3649568