豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type,PCV2）引起豬圓環(huán)病毒相關疾病（porcine circovirus-associated diseases,PCVDs）,PCV2感染首先侵害機體的免疫系統(tǒng),引起機體產生免疫抑制從而對多種病原易感,導致感染豬群病死率顯著升高,生產性能明顯下降,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。PCV2基因組包含11個重疊的開放閱讀框（ORFs）,其中最重要的是ORF2,ORF2編碼的衣殼蛋白Cap是PCV2的唯一結構蛋白,在病毒復制過程中,Cap參與了病毒基因組的入核以及成熟病毒粒子的組裝。信號傳導及轉錄激活蛋白5（signal transducer and activator of transcription5,STAT5）是一種多功能的轉錄因子,具有與DNA結合的特性。核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin 1,NPM1）是一種多功能的宿主蛋白,不僅參與多種細胞生理活動,還在多種病毒的復制過程中發(fā)揮重要作用。熱休克蛋白40 B6（heat shock protein40 B6,DNAJB6）屬于熱休克蛋白40（Hsp40）家族成員之... 

【文章來源】：西北農林科技大學陜西省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號對照表
文獻綜述
    第一章 動物病毒與宿主細胞蛋白互作研究進展
        1.1 宿主細胞蛋白在動物病毒復制過程中作用及機制
            1.1.1 NPM蛋白家族
            1.1.2 Hsp家族成員
            1.1.3 組蛋白分子伴侶
            1.1.4 MCM家族成員
            1.1.5 STAT家族成員
            1.1.6 TRIM家族成員
            1.1.7 波形蛋白
        1.2 PCV2與宿主細胞蛋白互作研究進展
            1.2.1 PCV2與宿主細胞蛋白互作在病毒吸附和入胞過程中作用與機制
            1.2.2 PCV2與宿主細胞蛋白互作在病毒入核和復制過程中作用與機制
            1.2.3 PCV2與宿主細胞蛋白互作在病毒出核及出胞過程中作用與機制
        1.3 本研究的目的意義
試驗研究
    第二章 PCV2 Cap宿主細胞互作蛋白篩選與鑒定
        2.1 材料
            2.1.1 細胞、病毒及菌株
            2.1.2 載體及主要試劑
            2.1.3 儀器設備
        2.2 方法
            2.2.1 PCV2 Cap宿主細胞互作蛋白的篩選
            2.2.2 stat5克隆及真核表達載體的構建
            2.2.3 npm1克隆及真核表達載體的構建
            2.2.4 dnajb6克隆及真核表達載體的構建
            2.2.5 不同種屬來源的STAT5、NPM1及DNAJB6 序列比對
            2.2.6 激光共聚焦檢測STAT5、NPM1及DNAJB6 亞細胞定位
            2.2.7 試驗動物及分組設計
            2.2.8 STAT5、NPM1、DNAJB6的m RNA水平檢測
            2.2.9 組織STAT5、NPM1、DNAJB6 表達情況檢測
            2.2.10 數(shù)據(jù)分析
        2.3 結果
            2.3.1 PCV2 Cap宿主互作蛋白的篩選與鑒定
            2.3.2 stat5克隆及真核表達載體的構建與鑒定
            2.3.3 npm1克隆及真核表達載體的構建與鑒定
            2.3.4 dnajb6克隆及真核表達載體的構建與鑒定
            2.3.5 STAT5序列比對分析
            2.3.6 NPM1序列比對分析
            2.3.7 DNAJB6序列比對分析
            2.3.8 STAT5在PCV2 感染細胞中的亞細胞定位
            2.3.9 NPM1在PCV2 感染細胞中的亞細胞定位
            2.3.10 DNAJB6在PCV2 感染細胞中的亞細胞定位
            2.3.11 STAT5在PCV2 感染豬組織中的表達量變化
            2.3.12 NPM1在PCV2 感染豬組織中的表達變化
            2.3.13 DNAJB6在PCV2 感染豬組織中的表達變化
        2.4 討論
        2.5 小結
    第三章 宿主細胞蛋白STAT5在PCV2 復制過程中作用及機制
        3.1 材料
            3.1.1 細胞、病毒及菌種
            3.1.2 載體、主要試劑
            3.1.3 儀器設備
        3.2 方法
            3.2.1 stat5原核表達載體的構建
            3.2.2 免疫共沉淀檢測Cap和 STAT5 的互作
            3.2.3 GST-pull down檢測Cap和 STAT5 的互作
            3.2.4 干擾stat5 表達對PCV2 復制的影響
            3.2.5 DNA pull-down檢測STAT5與PCV2 DNA互作區(qū)域
            3.2.6 PCV2 DNA結合活性缺失的PCV2 突變毒株構建與鑒定
            3.2.7 熒光原位雜交(FISH)檢測突變毒株的復制情況
            3.2.8 熒光定量PCR檢測突變毒株的DNA拷貝數(shù)
            3.2.9 數(shù)據(jù)分析
        3.3 結果
            3.3.1 STAT5原核表達載體的鑒定
            3.3.2 免疫共沉淀檢測Cap與 STAT5 互作
            3.3.3 GST-pull down鑒定Cap和 STAT5 互作
            3.3.4 干擾stat5 表達顯著抑制 PCV2 的復制
            3.3.5 PCV2突變毒株的構建與鑒定
            3.3.6 DNA pull down驗證PCV2 DNA與 STAT5 互作區(qū)域
            3.3.7 突變毒株PCV2-MDS在細胞內的復制情況
        3.4 討論
        3.5 小結
    第四章 宿主細胞蛋白NPM1在PCV2 復制過程中作用及機制
        4.1 材料
            4.1.1 細胞、病毒及菌株
            4.1.2 載體和主要試劑
            4.1.3 儀器設備
        4.2 方法
            4.2.1 干擾npm1 表達對PCV2 復制影響
            4.2.2 干擾npm1 表達對PCV2 Cap表達影響
            4.2.3 利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除PK-15中npm1
            4.2.4 NPM1及截短體原核表達載體的構建
            4.2.5 Cap及截短體真核表達載體的構建
            4.2.6 GST-pull down檢測Cap及其截短體與NPM1 的互作
            4.2.7 NPM1 結合活性缺失的PCV2 突變毒株的構建與鑒定
            4.2.8 熒光定量PCR檢測PCV2 突變毒株的復制水平
            4.2.9 熒光原位雜交(FISH)檢測突變毒株的復制情況
        4.3 結果
            4.3.1 干擾npm1對Cap表達和PCV2 DNA復制影響
            4.3.2 npm1敲除的 PK-15 建立與鑒定
            4.3.3 GST-pull down 檢測 Cap、NPM1 以及 STAT5 之間的互作
            4.3.4 NPM1及截短體原核表達載體的構建與鑒定
            4.3.5 Cap及截短體真核表達載體的構建與鑒定
            4.3.6 GST-pull down確定NPM1與Cap互作區(qū)域
            4.3.7 NPM1 結合活性缺失的PCV2 突變毒株構建與鑒定
            4.3.8 PCV2 突變毒株PCV2-Nm A復制水平
        4.4 討論
        4.5 小結
    第五章 宿主細胞蛋白DNAJB6在PCV2 復制過程中作用及機制
        5.1 材料
            5.1.1 細胞、病毒及菌株
            5.1.2 載體和主要試劑
            5.1.3 儀器設備
        5.2 方法
            5.2.1 熒光定量PCR檢測PCV2 拷貝數(shù)
            5.2.2 western blotting檢測DNAJB6和Cap的表達
            5.2.3 間接免疫熒光檢測Cap及 DNAJB6 的定位情況
            5.2.4 免疫共沉淀檢測Cap與 DNAJB6 的互作
            5.2.5 DNAJB6及截短體原核表達載體的構建
            5.2.6 Cap截短體真核表達載體的構建
            5.2.7 DNAJB6突變體真核表達載體的構建
            5.2.8 DNAJB6及截短體原核表達及純化鑒定
            5.2.9 GST-pull down檢測Cap及 DNAJB6 的互作
            5.2.10 激光共聚焦檢測PCV2及PCV2 Cap誘導的自噬小體
            5.2.11 相對熒光定量PCR檢測DNAJB6的m RNA水平
            5.2.12 利用si RNA干擾atg5 的表達
            5.2.13 抑制試驗
            5.2.14 數(shù)據(jù)分析
        5.3 結果
            5.3.1 PCV2 感染上調PK-15中DNAJB6 的表達
            5.3.2 DNAJB6與PCV2 Cap共定位
            5.3.3 DNAJB6與PCV2 Cap的互作
            5.3.4 DNAJB6全長及截短體原核表達載體的構建與鑒定
            5.3.5 Cap截短體真核表達載體的構建與鑒定
            5.3.6 鑒定DNAJB6與Cap的互作區(qū)域
            5.3.7 dnajb6敲除的 PK-15 細胞鑒定
            5.3.8 dnajb6敲除抑制自噬小體的形成和病毒復制
            5.3.9 DNAJB6過表達促進自噬體的形成和病毒復制
            5.3.10 DNAJB6與Cap的互作促進自噬體的形成
            5.3.11 DNAJB6與Cap的互作通過增強自噬促進PCV2 復制
        5.4 討論
        5.5 小結
結論
創(chuàng)新點
參考文獻
附錄
致謝
個人簡介


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]VIP對PI3K/Akt信號通路的影響在DC細胞胃癌抗原提呈中的作用研究[D]. 桂冠.南昌大學 2014



本文編號：3638639