發(fā)布時(shí)間：2017-05-10 03:14

  本文關(guān)鍵詞：深度測(cè)序鑒定玉米病毒及感病玉米組織中小RNA分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：玉米是世界上最重要的糧食作物之一,而玉米病毒病害的發(fā)生給玉米生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重?fù)p失。明確玉米病毒種類(lèi)及生物學(xué)特性是防治玉米病毒病發(fā)生的關(guān)鍵。深度測(cè)序技術(shù)突破了傳統(tǒng)病毒鑒定方法的局限性,能同時(shí)檢測(cè)植物樣品中已知的和未知的、含量高及含量低的所有RNA病毒、DNA病毒以及類(lèi)病毒。這種新的測(cè)序技術(shù)極大地革新了植物病毒的檢測(cè)方法,已成為目前病毒鑒定最為重要的前沿技術(shù)之一。 本研究利用小RNA深度測(cè)序技術(shù)鑒定了云南省和貴州省玉米病毒病的種類(lèi)。通過(guò)contigs拼接和比對(duì)共鑒定了7種玉米病毒,分別為3種未知的RNA病毒并依次暫命名為：玉米黃化花葉病毒(Maize yellow mosaic virus, MYMV),玉米相關(guān)的形影病毒(Maize-associated umbravirus, MAUV)以及玉米相關(guān)的整體病毒1(Maize-associated totivirus1,MATV1);1種國(guó)內(nèi)首次報(bào)道的DNA病毒：留尼旺玉米線條病毒云南分離物(Maize streak Reunion virus-YN isolate, MSRV-YN);3種已知的RNA病毒：玉米褪綠斑駁病毒(Maize chlorotic mottle virus, MCMV),甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV),南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)。利用病毒來(lái)源的contigs以及小RNA設(shè)計(jì)引物,對(duì)上述3種未知的RNA病毒以及MSRV-YN進(jìn)行了全長(zhǎng)基因組的克隆。 MYMV基因組全長(zhǎng)5,642nt,共編碼6個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame, ORF),其ORF的大小及編碼策略與黃癥病毒科馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus, Luteoviridae)成員非常相似。全基因組核苷酸進(jìn)化樹(shù)分析以及6個(gè)ORFs的氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)分析均顯示MYMV與黃癥病毒科馬鈴薯卷葉病毒屬病毒成員聚為一簇,與該屬成員玉米黃矮病毒-ⅠMV(Maize yellow dwarf virus-RMV)形成一個(gè)小的分支,具有最高的序列同源性,兩者核苷酸序列相似性為73%,表明MYMV是該屬的一個(gè)新的病毒成員。同時(shí),構(gòu)建了MYMV的全長(zhǎng)cDNA侵染性克隆,RT-PCR及Northern blot結(jié)果均顯示該侵染性克隆能成功地系統(tǒng)侵染本氏煙(Nicotiana benthamiana)。我們還證實(shí)MYMV編碼的P0蛋白是一個(gè)較強(qiáng)的RNA沉默抑制子,能引起GFP轉(zhuǎn)基因16c本氏煙的局部和系統(tǒng)沉默。隨后,我們采集了云南省元江縣、元謀縣,貴州省長(zhǎng)順縣、獨(dú)山縣的玉米樣品,克隆了12個(gè)MYMV分離物的全長(zhǎng)基因組,并分析了全基因組核苷酸水平的變異進(jìn)化情況。分析結(jié)果顯示MYMV核苷酸水平整體變異低于4%,基因組上的遺傳多樣性存在較明顯的波動(dòng),但在外殼蛋白(Coat protein, CP)、運(yùn)動(dòng)蛋白(Movement protein, MP)等保守區(qū)域變異較小 MAUV基因組全長(zhǎng)3,040nt,編碼一個(gè)功能未知的ORF1和一個(gè)大小約80kDa的RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)融合蛋白。RdRp進(jìn)化樹(shù)分析顯示MAUV與番茄叢矮病毒科,形影病毒屬(Umbravirus, Tombusviridae)病毒成員聚為一簇,與該屬成員柑橘黃脈病毒(Citrus yellow vein-associated virus)具有最高的序列同源性,形成一個(gè)小的分支,兩者的核苷酸序列相似性和RdRp氨基酸序列相似性均為58.9%,表明了MAUV是形影病毒屬潛在的一個(gè)新的病毒成員。 MATV1基因組全長(zhǎng)3,956nt,編碼一個(gè)功能未知的ORF1和一個(gè)大小約92kDa的RdRp融合蛋白R(shí)dRp進(jìn)化樹(shù)分析顯示MATV1與整體病毒科整體病毒屬(Totivirus, Totiviridae)成員聚為一簇,與該屬成員黑樹(shù)莓病毒F (Black raspberry virus F)具有最高的序列同源性,聚為一個(gè)小的分支,兩者的核苷酸序列相似性為53.9%, RdRp氨基酸序列相似性46.0%,表明了MATV1是該屬潛在的一個(gè)新的病毒成員。 MSRV-YN是單鏈環(huán)狀DNA病毒,基因組全長(zhǎng)2,880nt,編碼位于病毒鏈上的運(yùn)動(dòng)蛋白(MP/V1)和外殼蛋白(CP/V2),互補(bǔ)鏈上的復(fù)制相關(guān)Rep蛋白和RepA蛋白共4個(gè)ORFs,具有玉米線條病毒屬基因組結(jié)構(gòu)的典型特征。利用依賴(lài)于滾環(huán)復(fù)制的限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法,將MSRV-YN侵染的樣品作為模板經(jīng)滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling circle amplification, RCA),用BamUl限制性內(nèi)切酶單酶切位點(diǎn)對(duì)RCA的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切割,得到了一條大小約3kb的單一條帶。進(jìn)一步的全基因組核苷酸序列進(jìn)化樹(shù)分析顯示MSRV-YN與雙生病毒科玉米線條病毒屬(Mastrevirus, Geminiviridae)成員具有最高的序列相似性,與該屬成員留尼旺玉米線條病毒(Maize streak Reunion vir淞)具有最高的全基因組核苷酸序列相似性,同源性達(dá)96.3%。 小NA是植物生長(zhǎng)發(fā)育及環(huán)境響應(yīng)的重要調(diào)節(jié)元件,處于基因表達(dá)調(diào)控的中心位置,了解MCMV侵染玉米的不同時(shí)間點(diǎn)的microRNA表達(dá)變化及調(diào)控規(guī)律對(duì)于病毒侵染植物以及植物抗病毒作用機(jī)制研究具有重要意義。利用小RNA深度測(cè)序技術(shù),首次構(gòu)建了MCMV侵染玉米后第15天(MA-M)和30天(MA-MI)葉片的小RNA文庫(kù)。通過(guò)生物信息學(xué)分析共鑒定了321個(gè)已知的miRNA,組成26個(gè)已知的miRNA家族；同時(shí)還預(yù)測(cè)了379個(gè)新的miRNA。我們還對(duì)這些rniRNA的靶基因及其功能進(jìn)行了預(yù)測(cè),這為下一步研究靶基因作用方式和作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。我們還發(fā)現(xiàn)病毒侵染的這兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)共有16種顯著差異表達(dá)的已知miRNA,其中7種為下調(diào)表達(dá),9種為上調(diào)表達(dá),共隸屬于10個(gè)miRNA家族。利用qRT-PCR技術(shù)分析了部分miRNA的表達(dá)水平,結(jié)果表明深度測(cè)序結(jié)果具有可靠性。此外,還分析了MCMV侵染的玉米葉片組織中病毒來(lái)源的siRNA (Small interfering RNA)。發(fā)現(xiàn)病毒侵染的第15天和第30天都能產(chǎn)生大量病毒來(lái)源的siRNA,且主要都是來(lái)源于病毒鏈,這些病毒來(lái)源的siRNA或跟寄主的抗病毒相關(guān)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),隨著侵染后期病毒滴度的下降,這些病毒來(lái)源的siRNA的數(shù)量也有所下降,熱點(diǎn)區(qū)分布也表現(xiàn)出一定程度的不一致,在侵染第15天時(shí)基因組1100nt和2899nt處是產(chǎn)生siRNA的熱點(diǎn)區(qū)(Hot spot),而在侵染第30天時(shí),該熱點(diǎn)區(qū)幾乎沒(méi)有病毒來(lái)源的siRNA產(chǎn)生了(Cold spot)。 植物病毒的協(xié)生作用能導(dǎo)致其中一種或兩種病毒的積累量較單獨(dú)侵染時(shí)增加,并且能引起比其中任何一種病毒單獨(dú)侵染更加嚴(yán)重的病毒病害癥狀。為探究MCMV和SCMV復(fù)合侵染引起玉米致死性壞死病的機(jī)制,分別構(gòu)建了MCMV-單獨(dú)侵染(MA-M)、SCMV單獨(dú)侵染(MA-S)、 MCMV和SCMV復(fù)合侵染(MA-MS)以及沒(méi)有病毒侵染的玉米葉片(MA-H)的小分子RNA文庫(kù)并進(jìn)行深度測(cè)序。通過(guò)生物信息學(xué)分析,在四個(gè)小RNA文庫(kù)中共鑒定了321種已知fniRNA。分析MA-M_MA-H、A-S_MA-H及MA-MS_MA-H之間共有的以及特有的差異表達(dá)miRNA,發(fā)現(xiàn)三組共有的差異表達(dá)的已知miRNA有28種,MA-M_MA-H、 MA-S_MA-H及MA-MS_MA-H各自特有的差異表達(dá)的miRNA分別有8、6、28種,對(duì)這些共有的和特有的差異表達(dá)的已知miRNA進(jìn)行了GO聚類(lèi)分析。利用qRT-PCR技術(shù)分析了部分miRNA的表達(dá)水平,結(jié)果表明深度測(cè)序結(jié)果具有可靠性。進(jìn)一步預(yù)測(cè)了493個(gè)新的miRNA,并分析了三組共有的及特有的差異表達(dá)的novel miRNA,發(fā)現(xiàn)共有的差異表達(dá)的novel miRNA有34種,MA-M_MA-H、 MA-S_MA-H及MA-MS_MA-H各自特有的差異表達(dá)的novel miRNA分別有16、25、20種,這些新的miRNA絕大部分是由于病毒侵染所誘導(dǎo)產(chǎn)生的。對(duì)這些共有的和特有的差異表達(dá)的novel miRNA進(jìn)行了GO聚類(lèi)分析,發(fā)現(xiàn)其靶基因在病毒的運(yùn)動(dòng)、病毒與宿主的互作中有顯著富集,表明新的miRNAs對(duì)病毒侵染和寄主抗病毒貢獻(xiàn)較大。最后,還分析了病毒來(lái)源的siRNA在病毒基因組中的分布情況。這些工作為深入解析植物協(xié)生作用的致病機(jī)理以及植物抗病毒基因工程提供了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：小RNA深度測(cè)序 病毒鑒定 miRNA 病毒來(lái)源的siRNA
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S435.13
【目錄】：

• 致謝6-8
• 摘要8-12
• Abstract12-16
• 目錄16-20
• 1 緒論20-48
• 1.1 玉米病毒研究進(jìn)展20-27
• 1.1.1 引起玉米病毒病害的主要病毒20-25
• 1.1.2 植物病毒協(xié)生作用研究進(jìn)展25-27
• 1.2 植物病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展27-42
• 1.2.1 生物學(xué)檢測(cè)法27
• 1.2.2 電子顯微鏡檢測(cè)法27-29
• 1.2.3 血清學(xué)檢測(cè)法29-30
• 1.2.4 分子生物學(xué)檢測(cè)法30-34
• 1.2.5 第二代測(cè)序(Next-generation sequencing,NGS)檢測(cè)法34-42
• 1.3 植物miRNA概況及研究進(jìn)展42-48
• 1.3.1 植物miRNA的形成43-44
• 1.3.2 植物miRNA的作用機(jī)制及其生物學(xué)功能44
• 1.3.3 植物miRNA的研究方法44-48
• 2 實(shí)驗(yàn)方法48-65
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器48-49
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料48
• 2.1.2 試劑與儀器48-49
• 2.2 常用的分子生物學(xué)技術(shù)49-62
• 2.2.1 普通PCR49
• 2.2.2 PCR產(chǎn)物回收純化49-50
• 2.2.3 質(zhì)粒提取50-51
• 2.2.4 連接反應(yīng)51-52
• 2.2.5 感受態(tài)細(xì)胞的制備52
• 2.2.6 轉(zhuǎn)化52-53
• 2.2.7 菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒53
• 2.2.8 酶切鑒定重組質(zhì)粒53
• 2.2.9 RACE-PCR(Rapid Amplification of cDNA Ends-PCR)53-56
• 2.2.10 玉米葉片總RNA的提取56-58
• 2.2.11 Northern印跡分析(Northern Blot)58-60
• 2.2.12 植物RNA的反轉(zhuǎn)錄(參考天根試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))60-61
• 2.2.13 Western印跡分析(Western Blot)61-62
• 2.2.14 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)62
• 2.3 生物信息學(xué)分析62-65
• 2.3.1 原始數(shù)據(jù)處理及分析62-63
• 2.3.2 病毒來(lái)源的小RNA分析63-64
• 2.3.3 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建64
• 2.3.4 基因組結(jié)構(gòu)分析及假結(jié)預(yù)測(cè)64
• 2.3.5 病毒的分子變異進(jìn)化分析64-65
• 3 利用小RNA深度測(cè)序技術(shù)鑒定玉米病毒65-137
• 3.1 材料和方法65-74
• 3.1.1 樣品的采集和處理65
• 3.1.2 小RNA深度測(cè)序樣品的準(zhǔn)備及樣品送測(cè)65-67
• 3.1.3 小RNA深度測(cè)序結(jié)果分析67-68
• 3.1.4 病毒侵染性克隆的構(gòu)建68-71
• 3.1.5 病毒編碼的沉默抑制子研究71-74
• 3.2 結(jié)果與分析74-134
• 3.2.1 小RNA深度測(cè)序鑒定未知的玉米R(shí)NA病毒74-119
• 3.2.2 小RNA深度測(cè)序鑒定已知的玉米DNA病毒119-128
• 3.2.3 小RNA深度測(cè)序鑒定已知的玉米病毒128-130
• 3.2.4 田間樣品病毒復(fù)合侵染情況分析130-134
• 3.3 討論134-137
• 4 玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)侵染玉米的小RNA分析137-165
• 4.1 材料與方法137-142
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料及樣品的收集處理137
• 4.1.2 樣品的準(zhǔn)備與RNA提取137
• 4.1.3 玉米小RNA文庫(kù)的構(gòu)建和Illumia測(cè)序137-138
• 4.1.4 小RNA深度測(cè)序數(shù)據(jù)分析138-140
• 4.1.5 熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證差異表達(dá)miRNA140-142
• 4.2 結(jié)果與分析142-164
• 4.2.1 病毒侵染植株癥狀及ELISA檢測(cè)病毒滴度142-143
• 4.2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)量及長(zhǎng)度分布143-144
• 4.2.3 公共的及特有的序列144-145
• 4.2.4 基因組比對(duì)145-146
• 4.2.5 已知miRNA的分析146-153
• 4.2.6 新的miRNA及其靶基因預(yù)測(cè)153-157
• 4.2.7 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNA和新的miRNA157-159
• 4.2.8 病毒來(lái)源的siRNA分析159-164
• 4.3 討論164-165
• 5 玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)和甘蔗花葉病毒(SCMV)復(fù)合侵染玉米的小RNA分析165-195
• 5.1 材料與方法166-167
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料166
• 5.1.2 毒源166
• 5.1.3 樣品的準(zhǔn)備與RNA提取166-167
• 5.1.4 小RNA文庫(kù)的構(gòu)建和Illumia測(cè)序167
• 5.1.5 小RNA深度測(cè)序數(shù)據(jù)分析167
• 5.2 結(jié)果與分析167-192
• 5.2.1 SCMV毒源的分離167-168
• 5.2.2 病毒侵染植株癥狀及ELISA檢測(cè)病毒滴度168-170
• 5.2.3 數(shù)據(jù)質(zhì)量及長(zhǎng)度分布170-171
• 5.2.4 公共的及特有的序列171-172
• 5.2.5 基因組的比對(duì)172
• 5.2.6 已知miRNA的分析172-181
• 5.2.7 新的miRNA及其靶基因預(yù)測(cè)181-189
• 5.2.8 qRT-PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果189
• 5.2.9 病毒來(lái)源的小RNA的熱點(diǎn)區(qū)分析189-192
• 5.3 討論192-195
• 附錄Ⅰ 參考文獻(xiàn)195-215
• 附錄Ⅱ 本論文所用病毒縮寫(xiě)及中英文對(duì)照215-216
• 附錄Ⅲ 常用緩沖液和培養(yǎng)基配方216-222
• 附錄Ⅳ 本論文所用術(shù)語(yǔ)縮寫(xiě)詞及中英文對(duì)照222-224

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 洪健,陳集雙,周雪平,李德葆;植物病毒的電鏡診斷[J];電子顯微學(xué)報(bào);1999年03期

2 杜琳;鐘先鋒;陳劍泓;易軍鵬;;植物病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J];農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊);2007年07期

3 袁小環(huán),李青;血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法檢測(cè)植物病毒研究進(jìn)展[J];熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué);2001年06期

4 施曼玲,周雪平;植物病毒病的診斷技術(shù)[J];微生物學(xué)通報(bào);2000年02期

5 李凡;林奇英;陳海如;謝聯(lián)輝;;幽影病毒屬病毒的研究現(xiàn)狀與展望[J];微生物學(xué)報(bào);2006年06期

6 朱建裕,朱水芳,廖曉蘭,高必達(dá);實(shí)時(shí)熒光RT-PCR一步法檢測(cè)番茄環(huán)斑病毒[J];植物病理學(xué)報(bào);2003年04期

7 朱昀;王猛;賈志偉;練云;金穎;王國(guó)英;;一種從富含多糖的玉米幼穗中提取RNA的方法[J];植物學(xué)通報(bào);2007年05期

8 蘇秀;徐毅;陳莎;傅帥;錢(qián)亞娟;張立欽;周雪平;;利用小RNA深度測(cè)序和組裝技術(shù)鑒定紫藤花葉病病原[J];植物病理學(xué)報(bào);2015年01期

  本文關(guān)鍵詞：深度測(cè)序鑒定玉米病毒及感病玉米組織中小RNA分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：353899