本文關(guān)鍵詞：基于RNA-Seq解析小桐子抗冷性形成的分子機(jī)制及其關(guān)鍵基因的克隆與功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：為緩解不斷增加的能源需求與有限化石燃料儲(chǔ)備以及環(huán)境惡化之間的矛盾,尋找更加生態(tài)、可持續(xù)再生的替代能源已成為未來(lái)新能源的發(fā)展方向。利用能源植物生產(chǎn)生物柴油與生物酒精類(lèi)燃料是目前研究的熱點(diǎn)。其中,小桐子作為一種新興的能源植物,因其種子含油量高可制備生物柴油、不與糧食作物爭(zhēng)地及改良生態(tài)環(huán)境等方面的特性而備受關(guān)注。由于起源熱帶,冷害成為限制小桐子產(chǎn)量及種植面積進(jìn)一步擴(kuò)大的主要因素。因此,深入研究小桐子的抗冷性形成機(jī)制并利用基因工程手段對(duì)其進(jìn)行改良,培育耐冷新品種,是目前亟待解決的種質(zhì)問(wèn)題。本研究中,我們通過(guò)Illumina Hiseq 2000高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)小桐子低溫鍛煉條件下的轉(zhuǎn)錄組(Transcriptome)進(jìn)行了測(cè)序,共獲得了55,112,142條clean reads片段,包含4,960,092,780nt。經(jīng)過(guò)從頭拼接,共得到106,749條序列重疊群(Contig),平均長(zhǎng)度為338bp;進(jìn)一步組裝得到45,251條Unigene序列,平均長(zhǎng)度為789bp。通過(guò)Blast序列比對(duì)與ESTscan軟件預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)有34,274條Unigenes(75.74%)包含完整或部分的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(33,362條通過(guò)Blast比對(duì)得到,912條通過(guò)ESTscan軟件預(yù)測(cè)得到)。有35,791條Unigenes注釋到了如Nr、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG等不同蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。其中,27,293條Unigenes注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中的61個(gè)功能組中;11,887條Unigenes注釋到了COG數(shù)據(jù)庫(kù)中25個(gè)功能蛋白家族中;18,787條Unigenes注釋到了KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的128條主要的代謝途徑中。另外,45,251條Unigenes中共鑒定到6665個(gè)SSR位點(diǎn),分布于5922條Unigenes中,平均長(zhǎng)度12bp,平均發(fā)生頻率為13.09%,SSR種類(lèi)主要以單、二及三核苷酸重復(fù)為主,共占94.49%�；谵D(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù),我們對(duì)小桐子12℃低溫鍛煉12h、24h、48h的葉片材料進(jìn)行了數(shù)字基因表達(dá)譜(Digital Gene Expression Profiling,DGE)的測(cè)序分析。與對(duì)照相比,小桐子經(jīng)過(guò)12℃低溫鍛煉共發(fā)現(xiàn)4185個(gè)差異表達(dá)基因,在鍛煉12h、24h、48h分別有1915、2085、3213個(gè)基因表達(dá)表現(xiàn)出差異性,在三個(gè)鍛煉時(shí)間點(diǎn)都表現(xiàn)出差異表達(dá)的基因有553個(gè)。進(jìn)一步分析表明,經(jīng)過(guò)12℃低溫鍛煉12h、24h、48h,分別有1211、1302、2516個(gè)基因表達(dá)上調(diào),同時(shí)分別有704、783、697個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。上調(diào)表達(dá)的基因主要涉及電子傳遞與氧化還原平衡、水解酶與小分子運(yùn)輸?shù)鞍准易濉NA或RNA結(jié)合蛋白類(lèi)、各類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子如AP2/ERF與ABC等。對(duì)于主要代謝途徑分析表明,小桐子在低溫鍛煉條件下,淀粉的分解代謝加劇,積累的滲透調(diào)節(jié)可溶性糖可能主要以肌醇、肌醇半乳糖苷以及蔗糖為主。而不依賴(lài)aba的cbf冷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,低溫鍛煉條件下各層次信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)膜蛋白、激酶、cbf及其它多種轉(zhuǎn)錄因子都上調(diào)表達(dá),說(shuō)明cbf信號(hào)系統(tǒng)在小桐子抗冷性形成中起著重要作用。同時(shí),小桐子在低溫鍛煉12h、24h、48h下,新誘導(dǎo)表達(dá)基因分別為238、160、330個(gè),其中在不同鍛煉時(shí)間點(diǎn)都誘導(dǎo)表達(dá)的新基因有61個(gè),主要編碼轉(zhuǎn)移酶家族、dna結(jié)合蛋白家族、受體蛋白家族及氧化還原酶家族等。結(jié)合小桐子抗冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄組與數(shù)字基因表達(dá)譜的測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果,本工作還揭示了22個(gè)小桐子抗冷相關(guān)基因在小桐子抗冷性形成過(guò)程中的表達(dá)信息,同時(shí)也揭示了它們的組織表達(dá)特異性。22個(gè)基因在根中基本上都有基礎(chǔ)表達(dá),但隨著低溫鍛煉時(shí)間的延長(zhǎng),其表達(dá)量總體表現(xiàn)為先下調(diào)后上調(diào)的表達(dá)模式,一般在12℃低溫鍛煉24h時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量,其中以nsltpa、ga20ox、admt、dxs、pip2、dhn2、lea5表現(xiàn)最為顯著。在莖中,所篩選的22個(gè)基因有18個(gè)對(duì)低溫鍛煉應(yīng)答不明顯,與對(duì)照一樣都表現(xiàn)為本底表達(dá);gsts、apx1、lea5表達(dá)則表現(xiàn)出低溫誘導(dǎo)性;而pdi基因表達(dá)量甚微。在葉中,22個(gè)基因表達(dá)差異性最大,大部分基因表現(xiàn)為隨低溫鍛煉時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上調(diào)表達(dá),而且在12℃低溫鍛煉24h時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量。另外,部分低溫鍛煉新表達(dá)基因在對(duì)照條件下沒(méi)有本底表達(dá),這也與數(shù)字基因表達(dá)譜分析結(jié)果一致,如dnaj、chs、lrr-rlk、admt、dxs、apx1等基因。為進(jìn)一步理解小桐子抗冷性形成機(jī)制,我們從小桐子中克隆了低溫鍛煉下差異表達(dá)變化較大的gs3、nsltpa基因,低溫新誘導(dǎo)表達(dá)的chs、ga20ox基因,抗氧化和維持大分子功能相關(guān)的pdi與msra基因,以及cbf基因家族的兩個(gè)成員cbf1與cbf2基因。氨基酸序列分析表明,gs3包含由7個(gè)平行β-折疊及8個(gè)氨基酸殘基組成的保守活性中心,而nsltpa包含由4對(duì)二硫鍵(由8個(gè)cys殘基形成)維系的4段α-螺旋構(gòu)成的基序結(jié)構(gòu),都屬于多基因家族,且分化上存在跳躍現(xiàn)象。chs屬于pks家族,存在典型的查耳酮合酶及對(duì)苯乙烯合酶活性位點(diǎn)、產(chǎn)物結(jié)合位點(diǎn)與丙二酰-coa結(jié)合位點(diǎn);而ga20ox屬于2-odd家族,存在雙層β-桶結(jié)構(gòu)及h-d-h基序;兩者在進(jìn)化上都較為保守,與其它植物的直系同源蛋白都存在至少70%以上的序列相似性。pdi屬于硫氧還蛋白家族,而我們克隆的小桐子pdi蛋白屬于典型的l型成員,具有-a-b-b′-a′-結(jié)構(gòu)域排列方式與兩個(gè)-cghc-催化核心,并具備-kdel-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號(hào),錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上,發(fā)揮二硫鍵氧化、還原及異構(gòu)化的功能。msra屬于msr家族a亞家族,與該家族中的msrb、frmsr在氨基酸一級(jí)序列、高級(jí)結(jié)構(gòu)等方面沒(méi)有同源性,具有a亞家族蛋白的典型-gcgwp-保守序列以及3個(gè)α-螺旋包裹的6個(gè)β-折疊片層組成的α/β卷狀結(jié)構(gòu);克隆的CBF1基因氨基酸序列中存在一個(gè)典型AP2基序,負(fù)責(zé)結(jié)合COR基因的CRT/DRE順式作用元件,但沒(méi)有鑒定到保守的Val-Glu-Glu殘基,而是僅發(fā)現(xiàn)了中間部位的Glu。對(duì)其啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn),CBF1基因啟動(dòng)子區(qū)域包含典型的TATA框、CAAT框,以及ICE結(jié)合元件、MYB結(jié)合元件、MYC結(jié)合元件,表明CBF1受多種激素等信號(hào)的誘導(dǎo),并參與多種逆境脅迫的應(yīng)答。同時(shí),重組GS3、nsLTPA、CHS及PDI酵母在低溫下的長(zhǎng)勢(shì)都明顯好于對(duì)照酵母菌,暗示這些基因與小桐子抗冷性直接相關(guān),對(duì)于小桐子抗冷性的基因工程改良具有較大應(yīng)用潛力�？傊�,我們?cè)诒狙芯恐型ㄟ^(guò)高通量測(cè)序技術(shù)得到了小桐子低溫鍛煉條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),通過(guò)數(shù)字基因表達(dá)譜分析揭示了小桐子抗冷相關(guān)基因的表達(dá)模式及參與的主要代謝途徑,并且實(shí)驗(yàn)鑒定了22個(gè)抗冷相關(guān)基因在根、莖及葉中的表達(dá)模式。另外,基于以上結(jié)果綜合篩選,克隆了8個(gè)關(guān)鍵基因的全長(zhǎng)cDNA,并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析及功能鑒定。從意義上而言,本研究初步闡明了小桐子低溫鍛煉下抗冷性形成的分子機(jī)制,得到的Unigenes序列極大地豐富了目前NCBI中小桐子的核酸數(shù)據(jù)庫(kù),為后續(xù)抗冷相關(guān)基因的克隆并通過(guò)基因工程手段對(duì)小桐子進(jìn)行改良提供了理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：小桐子 低溫鍛煉 抗冷性 轉(zhuǎn)錄組 數(shù)字基因表達(dá)譜 基因克隆 酵母表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：云南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S794.9
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-10
• 縮略詞表10-17
• 第1章 研究背景17-49
• 1.1 研究開(kāi)發(fā)和利用能源植物是產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略的需求17-19
• 1.2 發(fā)展能源植物與生物柴油產(chǎn)業(yè)面臨的問(wèn)題19
• 1.3 小桐子是具有巨大開(kāi)發(fā)潛力的能源植物19-21
• 1.4 小桐子產(chǎn)業(yè)化存在的問(wèn)題21-22
• 1.5 低溫脅迫下植物生理、生化及分子調(diào)節(jié)22-44
• 1.5.1 植物的冷害及其機(jī)理22
• 1.5.2 冷害與植物的抗冷性22-35
• 1.5.2.1 膜系統(tǒng)與植物的抗冷性22-27
• 1.5.2.2 抗氧化系統(tǒng)與植物的抗冷性27-30
• 1.5.2.3 細(xì)胞內(nèi)容物與植物抗冷性30-35
• 1.5.3 植物抗冷性的分子生物學(xué)35-44
• 1.5.3.1 植物響應(yīng)低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)35-39
• 1.5.3.2 miRNA差異表達(dá)與植物抗冷性39-40
• 1.5.3.3 小桐子基因組及抗冷相關(guān)功能基因的研究40-44
• 1.6 研究契機(jī)44-45
• 1.7 研究?jī)?nèi)容45-46
• 1.8 研究目標(biāo)46
• 1.9 研究特色與創(chuàng)新性46
• 1.10 研究技術(shù)路線(xiàn)46-49
• 第2章 材料與方法49-70
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料49-51
• 2.1.1 小桐子49
• 2.1.2 大腸桿菌49-50
• 2.1.3 酵母菌50
• 2.1.4 克隆載體與表達(dá)載體50-51
• 2.2 培養(yǎng)基51-52
• 2.3 抗生素52
• 2.4 菌種保存52-53
• 2.5 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備53
• 2.6 試劑與耗材53-55
• 2.6.1 生化與分子生物學(xué)試劑53
• 2.6.2 常用試劑配制53-55
• 2.7 實(shí)驗(yàn)方法55-68
• 2.7.1 基因組DNA的提取與純化（試劑盒）55-56
• 2.7.2 RNA的提取與純化56-59
• 2.7.2.1 兩步裂解法（用于抗冷相關(guān)基因的半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)）57-58
• 2.7.2.2 試劑盒TransZol法（用于基因克隆實(shí)驗(yàn)）58-59
• 2.7.3 核酸的瓊脂糖凝膠電泳59
• 2.7.4 反轉(zhuǎn)錄或第一鏈cDNA的合成59
• 2.7.5 PCR反應(yīng)體系59-61
• 2.7.5.1 Dream Taq DNA Plymerase反應(yīng)體系及程序59-60
• 2.7.5.2 TransTaq DNA Polymerase High Fidelity (HiFi) 反應(yīng)體系及程序60
• 2.7.5.3 TransStart Taq DNA Polymerase反應(yīng)體系及程序60-61
• 2.7.5.4 2×EasyTaq PCR SuperMix反應(yīng)體系及程序61
• 2.7.6 DNA瓊脂糖凝膠純化回收61-62
• 2.7.7 PCR產(chǎn)物純化回收62
• 2.7.8 質(zhì)粒DNA提取62-63
• 2.7.9 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備63
• 2.7.10 酵母菌感受態(tài)細(xì)胞的制備63-64
• 2.7.10.1 LiAc/TE法63
• 2.7.10.2 LiAc法63-64
• 2.7.11 克隆與大腸桿菌的轉(zhuǎn)化64-66
• 2.7.11.1 TA克�。ɑ蚩寺。�64-65
• 2.7.11.2 DNA的酶切反應(yīng)（雙酶切）65-66
• 2.7.11.3 DNA的連接反應(yīng)（酵母表達(dá)載體的構(gòu)建）66
• 2.7.12 酵母菌的轉(zhuǎn)化與陽(yáng)性驗(yàn)證66-68
• 2.7.12.1 LiAc/TE法66-67
• 2.7.12.2 LiAc法（Gietz法）67-68
• 2.8 分子量標(biāo)準(zhǔn)68
• 2.9 主要的分析軟件68-70
• 第3章 低溫鍛煉提高小桐子抗冷性過(guò)程中轉(zhuǎn)錄組的解析70-91
• 3.1 研究的內(nèi)容與目標(biāo)70
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法70-72
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料70
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法70-72
• 3.2.2.1 RNA-Seq測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建70-71
• 3.2.2.2 測(cè)序reads去噪及序列從頭（de nevo）拼接71-72
• 3.2.2.3 Unigene數(shù)據(jù)的功能注釋、分類(lèi)及代謝途徑分析72
• 3.2.2.4 高表達(dá)Unigene數(shù)據(jù)的功能鑒定72
• 3.2.2.5 抗冷相關(guān)代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)分析72
• 3.2.2.6 簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記位點(diǎn)分析72
• 3.3 結(jié)果與分析72-86
• 3.3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)72-73
• 3.3.2 序列注釋及蛋白編碼框的識(shí)別73-76
• 3.3.3 功能基因注釋與分類(lèi)76-79
• 3.3.4 高表達(dá)量Unigenes的功能基因注釋分析79-80
• 3.3.5 轉(zhuǎn)錄組中抗冷相關(guān)Unigene表達(dá)分析80-82
• 3.3.6 基于轉(zhuǎn)錄組的SSR分子標(biāo)記分析82-86
• 3.4 討論86-90
• 3.5 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與提交NCBI90-91
• 第4章 低溫鍛煉提高小桐子抗冷性過(guò)程中數(shù)字基因表達(dá)譜的解析91-114
• 4.1 研究目標(biāo)與內(nèi)容91
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法91-94
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料91
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法91-94
• 4.2.2.1 數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序樣品的制備及測(cè)序91-93
• 4.2.2.2 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的數(shù)字基因表達(dá)譜Tag的功能注釋93
• 4.2.2.3 差異表達(dá)基因的GO功能聚類(lèi)及分析93
• 4.2.2.4 小桐子抗冷相關(guān)功能基因的差異表達(dá)分析與鑒定93-94
• 4.3 結(jié)果與分析94-108
• 4.3.1 數(shù)字基因表達(dá)譜Tag處理與統(tǒng)計(jì)94-98
• 4.3.2 小桐子低溫鍛煉條件下差異表達(dá)基因的鑒定98-102
• 4.3.3 小桐子低溫鍛煉條件下差異表達(dá)基因的GO功能聚類(lèi)分析102-103
• 4.3.4 小桐子抗冷相關(guān)代謝或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑差異表達(dá)基因的鑒定103-107
• 4.3.4.1 基于淀粉降解代謝的可溶性糖積累途徑差異表達(dá)基因的鑒定103-105
• 4.3.4.2 非ABA依賴(lài)的冷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑差異表達(dá)基因的鑒定105-107
• 4.3.5 小桐子低溫鍛煉條件下新表達(dá)基因的鑒定107-108
• 4.4 討論108-114
• 第5章 低溫鍛煉中小桐子關(guān)鍵功能基因的時(shí)空表達(dá)分析114-133
• 5.1 研究的目標(biāo)與內(nèi)容114
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法114-118
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料114
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)方法114-118
• 5.2.2.1 總RNA的提取、純化和定量檢測(cè)114
• 5.2.2.2 cDNA第一鏈的合成114
• 5.2.2.3 引物設(shè)計(jì)114-117
• 5.2.2.4 引物測(cè)試117
• 5.2.2.5 RT-PCR檢測(cè)117-118
• 5.2.2.6 基因表達(dá)模式的聚類(lèi)分析118
• 5.3 結(jié)果與分析118-128
• 5.3.1 總RNA的提取及質(zhì)量分析118-120
• 5.3.2 小桐子抗冷相關(guān)基因在不同器官中的表達(dá)特性120
• 5.3.3 冷鍛煉條件下抗冷相關(guān)基因的RT-PCR分析120-126
• 5.3.4 抗冷相關(guān)基因的表達(dá)模式聚類(lèi)分析126-128
• 5.4 討論128-133
• 第6章 GS3與nsLTPA基因的克隆及酵母功能驗(yàn)證133-154
• 6.1 研究的內(nèi)容與目標(biāo)133
• 6.2 材料與方法133-135
• 6.2.1 實(shí)驗(yàn)材料133
• 6.2.2 實(shí)驗(yàn)方法133-135
• 6.2.2.1 RNA的提取、純化及定量檢測(cè)133
• 6.2.2.2 cDNA第一鏈的合成133
• 6.2.2.3 Jc GS3與JcnsLTPA基因全長(zhǎng)cDNA的克隆133-134
• 6.2.2.4 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化134-135
• 6.2.2.5 重組酵母菌抗冷性功能驗(yàn)證135
• 6.3 結(jié)果與分析135-149
• 6.3.1 JcGS3與JcnsLTPA基因全長(zhǎng)cDNA的克隆135-137
• 6.3.2 GS3與nsLTPA的生物信息學(xué)分析137-146
• 6.3.2.1 Jc GS3與JcnsLTPA基因信息及結(jié)構(gòu)137-140
• 6.3.2.2 JcGS3與JcnsLTPA氨基酸序列功能元件鑒定140-143
• 6.3.2.3 JcGS3與JcnsLTPA的進(jìn)化分析143-145
• 6.3.2.4 JcGS3與JcnsLTPA高級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定及分析145-146
• 6.3.3 酵母表達(dá)載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化及抗冷性評(píng)價(jià)146-149
• 6.3.3.1 酵母表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化146-148
• 6.3.3.2 轉(zhuǎn)基因酵母的抗冷性評(píng)價(jià)148-149
• 6.4 討論149-154
• 6.4.1 JcGS3基因149-151
• 6.4.2 JcnsLTPA基因151-154
• 第7章 CHS與GA20ox基因的克隆及酵母功能驗(yàn)證154-173
• 7.1 研究的內(nèi)容與目標(biāo)154
• 7.2 材料與方法154-156
• 7.2.1 實(shí)驗(yàn)材料154
• 7.2.2 實(shí)驗(yàn)方法154-156
• 7.2.2.1 RNA的提取、純化及定量檢測(cè)154
• 7.2.2.2 cDNA第一鏈的合成154
• 7.2.2.3 Jc CHS與JcGA20ox基因全長(zhǎng)cDNA的克隆154-155
• 7.2.2.4 Jc CHS酵母表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化155
• 7.2.2.5 Jc CHS重組酵母菌抗冷性功能驗(yàn)證155-156
• 7.3 結(jié)果與分析156-169
• 7.3.1 JcCHS與JcGA20ox基因全長(zhǎng)c DNA的克隆156-157
• 7.3.2 JcCHS與JcGA20ox的生物信息學(xué)分析157-167
• 7.3.2.1 Jc CHS與JcGA20ox基因的初步分析157-159
• 7.3.2.2 JcCHS與Jc GA20ox氨基酸序列功能元件鑒定159-164
• 7.3.2.3 JcCHS與Jc GA20ox系統(tǒng)進(jìn)化分析164-166
• 7.3.2.4 JcCHS與Jc GA20ox的高級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定及分析166-167
• 7.3.3 JcCHS酵母表達(dá)載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及抗冷性評(píng)價(jià)167-169
• 7.3.3.1 Jc CHS酵母表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化167-168
• 7.3.3.2 Jc CHS重組酵母的抗冷性評(píng)價(jià)168-169
• 7.4 討論169-173
• 7.4.1 JcCHS基因169-171
• 7.4.2 JcGA20ox基因171-173
• 第8章 PDI與MSRA基因的克隆及酵母功能驗(yàn)證173-194
• 8.1 研究的內(nèi)容與目標(biāo)173
• 8.2 材料與方法173-175
• 8.2.1 實(shí)驗(yàn)材料173
• 8.2.2 實(shí)驗(yàn)方法173-175
• 8.2.2.1 RNA的提取、純化及定量檢測(cè)173
• 8.2.2.2 cDNA第一鏈的合成173
• 8.2.2.3 Jc PDI與Jc MSRA基因全長(zhǎng)cDNA的克隆173-174
• 8.2.2.4 Jc PDI酵母表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化174
• 8.2.2.5 Jc PDI重組酵母菌抗冷性功能驗(yàn)證174-175
• 8.3 結(jié)果與分析175-189
• 8.3.1 JcPDI與JcMSRA基因全長(zhǎng)c DNA的克隆175-176
• 8.3.2 JcPDI與JcMSRA的生物信息學(xué)分析176-187
• 8.3.2.1 JcPDI與Jc MSRA的初步分析176-180
• 8.3.2.2 JcPDI與Jc MSRA氨基酸序列功能元件鑒定180-183
• 8.3.2.3 JcPDI與Jc MSRA系統(tǒng)進(jìn)化分析183-185
• 8.3.2.4 JcPDI與Jc MSRA高級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定及分析185-187
• 8.3.3 JcPDI酵母表達(dá)載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及抗冷性評(píng)價(jià)187-189
• 8.3.3.1 Jc PDI酵母表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化187-188
• 8.3.3.2 Jc PDI重組酵母的抗冷性評(píng)價(jià)188-189
• 8.4 討論189-194
• 8.4.1 JcPDI基因189-191
• 8.4.2 JcMSR基因191-194
• 第9章 CBF1與CBF2基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建194-206
• 9.1 研究的內(nèi)容與目標(biāo)194
• 9.2 材料與方法194-195
• 9.2.1 實(shí)驗(yàn)材料194
• 9.2.2 實(shí)驗(yàn)方法194-195
• 9.2.2.1 RNA的提取、純化及定量檢測(cè)194
• 9.2.2.2 cDNA第一鏈的合成194
• 9.2.2.3 Jc CBF1與JcCBF2基因全長(zhǎng)cDNA的克隆194-195
• 9.2.2.4 Jc CBF1與JcCBF2酵母菌表達(dá)載體的構(gòu)建195
• 9.3 結(jié)果與分析195-204
• 9.3.1 JcCBF1與JcCBF2基因全長(zhǎng)cDNA的克隆195-196
• 9.3.2 JcCBF1與JcCBF2的生物信息學(xué)分析196-202
• 9.3.2.1 Jc CBF1與JcCBF2的初步分析196-198
• 9.3.2.2 JcCBF1與JcCBF2功能元件及結(jié)構(gòu)域鑒定198-202
• 9.3.3 JcCBF1與JcCBF2酵母菌表達(dá)載體的構(gòu)建202-204
• 9.4 討論204-206
• 第10章 研究結(jié)論與展望206-211
• 10.1 研究結(jié)論206-210
• 10.2 研究展望210-211
• 參考文獻(xiàn)211-229
• 致謝229-230
• 課題資助及論文發(fā)表情況230-231

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 王曉敏;劉凡值;張可元;龍英;龍飛;王定川;;2011年初貴州麻瘋樹(shù)凍害調(diào)查與分析[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年22期

2 羅通;鄧騖遠(yuǎn);陳放;;不同產(chǎn)地麻瘋樹(shù)的抗冷性研究[J];內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2006年04期

  本文關(guān)鍵詞：基于RNA-Seq解析小桐子抗冷性形成的分子機(jī)制及其關(guān)鍵基因的克隆與功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：352895