本文關(guān)鍵詞：鎘對河南華溪蟹脂肪積累與代謝的影響及毒性機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來,由于采礦、發(fā)電以及金屬冶煉等現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展,重金屬污染尤其是鎘的污染事件時有發(fā)生,使生物種群和生態(tài)系統(tǒng)受到嚴(yán)重破壞。研究發(fā)現(xiàn),鎘可以影響生物有機體內(nèi)的物質(zhì)和能量代謝等過程,嚴(yán)重時甚至改變物種的遷徙和卵子發(fā)生等與繁殖相關(guān)的生命活動。卵子發(fā)生是甲殼動物卵巢發(fā)育中的一個重要階段,卵母細(xì)胞成熟過程中卵黃磷蛋白原(Vitellogenin, Vg)的形成和積累是其主要特征。Vg通過進(jìn)一步的修飾和加工形成包含有脂肪和糖類等物質(zhì)的卵黃磷蛋白(Vitellin, Vn)可在卵母細(xì)胞中積累形成卵黃體。當(dāng)生物有機體受到外部環(huán)境脅迫時,通過消耗體內(nèi)積累的脂肪等物質(zhì)產(chǎn)生充足的能量以合成金屬硫蛋白(Metallothionein, MT)以緩解外部的影響。還原型輔酶Ⅱ(NADPH)作為生物體內(nèi)一種重要的還原力,不僅參與維持體內(nèi)谷胱甘肽系統(tǒng)的平衡、緩解外部的脅迫,還是脂肪合成中的重要因素。本學(xué)位論文在課題組前期研究的基礎(chǔ)上,從細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和生物化學(xué)等多層次綜合研究并分析了鎘亞慢性染毒后,對河南華溪蟹(Sinopotamon henanense)肝胰腺和卵巢組織中脂肪代謝的影響,闡明了鎘對生殖的影響機制。表明鎘對水生動物早期影響的生化和繁殖參數(shù),可以作為在水生生態(tài)毒理學(xué)研究中污染物對生物種群影響的重要指標(biāo)和科學(xué)依據(jù)。實驗中具體利用了比色法、透射電鏡技術(shù)(Transmission electron microscopy, TEM)、免疫學(xué)和凝膠過濾層析等方法。主要的生化指標(biāo)包括脂肪含量、甘油三酯(Triglyceride, TG)含量、ATP/ADP、 NADH/NAD、線粒體膜電位(Δψm)、NADPH/NADP+等參數(shù)；脂肪消化代謝相關(guān)的胰脂肪酶(Pancreatic lipase,PL)、脂肪轉(zhuǎn)運相關(guān)的脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase,LPL)及參與脂肪合成代謝的乙酰CoA羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAS)；線粒體能量合成代謝相關(guān)的己糖激酶(Glucokinase, GK)、NAD+-異檸檬酸脫氫酶(NAD+-linked isocitrate dehydrogenase,NAD+-IDH)、細(xì)胞色素C氧化酶(Cytochrome C oxidase,COX)等酶的活性及IDH和COX mRNA表達(dá)；NADPH合成依賴酶：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH)、蘋果酸酶(Malic enzyme, ME)、NADP+依賴型異檸檬酸脫氫酶(NADP+-linked isocitrate dehydrogenase,NADP+ -IDH)等酶的活性；參與緩解氧化脅迫的谷胱甘肽系統(tǒng)：還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量、GSH/GSSG、谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase,GR)活性、MT和脂質(zhì)過氧化指標(biāo)丙二醛(Malondialdehyde,MDA)。采用TEM手段觀察了鎘處理后肝胰腺細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等顯微結(jié)構(gòu)的改變。應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法,確定了Vg的核酸序列全長,通過生物信息學(xué)的方法對Vg進(jìn)行了分析；基于逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)方法,研究了該基因在不同組織內(nèi)的表達(dá),并通過Vg序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹；通過凝膠過濾層析法純化了成熟卵巢中的Vn,采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確定了Vn亞基數(shù)量及分子量；以純化的Vn為抗原,制備了Vn多克隆抗血清,并建立了可靠的Vn含量測定的ELISA方法；最后,運用酶聯(lián)免疫和實時熒光定量PCR等多種方法檢測了鎘暴露對肝胰腺和卵巢等組織中Vn含量、Vg mRNA表達(dá)及糖代謝和蛋白代謝的影響。結(jié)果顯示：首先,鎘在河南華溪蟹組織中的蓄積具有濃度和時間效應(yīng)關(guān)系。隨著鎘處理濃度的升高和處理時間的延長,肝胰腺和卵巢中鎘的蓄積量呈現(xiàn)升高趨勢,而脂肪的含量則呈現(xiàn)降低趨勢,導(dǎo)致肝胰腺和卵巢指數(shù)的降低進(jìn)而影響了組織器官的發(fā)育。鎘處理10d,淋巴液中TG含量顯著高于對照,但隨著時間的延長呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢。參與脂肪消化的PL和脂肪合成的ACC和FAS酶活高于對照組；鎘處理20d,PL、LPLACC和FAS活性均低于10d的鎘處理組和對照組,并隨著鎘濃度的升高呈現(xiàn)下降的趨勢。其次,與對照組相比,鎘處理10d后的各染毒組組織細(xì)胞內(nèi)NAD+-IDH口COX活性的增強及mRNA表達(dá)水平的上調(diào),引起了NADH含量及NADH/NAD的顯著增高,并由此導(dǎo)致了高水平的△ψm及ATP含量上升。然而,隨著鎘處理時間的延長,參與能量代謝的GK、IDH和COX酶活性及相關(guān)酶mRNA表達(dá)水平下降,且在鎘處理20d該指標(biāo)顯著低于對照組。TEM觀察發(fā)現(xiàn),線粒體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)腫脹、膜破裂、內(nèi)膜嵴變短、線粒體破裂和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷等現(xiàn)象,使組織細(xì)胞中的NADH含量和Δψm水平下降,最終導(dǎo)致ATP含量減少。還有,鎘處理早期,G6PDH、6PGDH、ME和NADP-IDH等酶活性升高加速了磷酸戊糖代謝等NADPH合成途徑,引起組織中NADPH含量上升；GR活力顯著升高導(dǎo)致谷胱甘肽氧化還原循環(huán)再生途徑得到加強,GSH合成速率升高。MT含量的顯著升高也表明在該階段蟹體具有較強的抗鎘脅迫能力。然而,隨著鎘處理時間的延長,體內(nèi)NADPH及GSH的合成代謝逐漸減弱。鎘處理20d, NADPH合成依賴的酶活力受到抑制,引起NADPH含量降低,谷胱甘肽氧化還原循環(huán)再生途徑也因此受阻；GR活性由于受到鎘的脅迫而出現(xiàn)降低。因此,鎘對NADPH合成及谷胱甘肽原循環(huán)中關(guān)鍵酶GR活性的抑制,導(dǎo)致GSH合成速率下降,并最終引發(fā)GSH含量的降低和耗竭。組織內(nèi)MT含量的降低和MT mRNA表達(dá)的下調(diào)表明,組織細(xì)胞螯合鎘的能力減弱,MDA含量顯著升高表明在該階段蟹體處于嚴(yán)重的氧化脅迫狀態(tài)。另外,河南華溪蟹Vg基因序列長度為7764 bp,其中閱讀框核苷酸序列為7701bp可編碼2566個氨基酸；由生物進(jìn)化樹分析得知,河南華溪蟹與中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)等蟹類在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近而與蝦類進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明,該蛋白由分子量為102、84和70KD的3個亞基組成；溪蟹Vn-ELISA方法的工作濃度范圍為125-2000ng/mL,定性檢測的靈敏度可達(dá)到15.62 ng/mL。同時,卵巢中Vn含量的測定結(jié)果中各批次間不存在顯著差異,且平均變異系數(shù)分別僅為7.81%,顯示該法具有較高的穩(wěn)定性和重復(fù)性。鎘暴露引起卵巢組織卵母細(xì)胞直徑的降低,同時肝胰腺和卵巢Vg-mRNA表達(dá)下調(diào),組織內(nèi)Vn含量的顯著降低,與鎘處理時間具有時間-效應(yīng)和濃度-效應(yīng)關(guān)系；經(jīng)鎘處理肝胰腺和卵巢組織內(nèi)糖原及蛋白含量顯著低于對照組的,其中在鎘暴露15d谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性增強,表明鎘處理后蟹體需要分解糖類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)以滿足能量的需求從而緩解鎘的脅迫。由以上實驗結(jié)果得出如下結(jié)論：第一,鎘影響河南華溪蟹肝胰腺和卵巢內(nèi)的脂肪積累；短期鎘暴露可以誘導(dǎo)脂肪消化和脂肪合成代謝相關(guān)酶活性升高,促進(jìn)脂類的消化、吸收和合成；長期鎘暴露,顯著影響脂肪消化、脂肪轉(zhuǎn)運以及脂肪合成代謝等過程,進(jìn)而阻礙了對體內(nèi)脂肪的積累并最終影響肝胰腺和卵巢的發(fā)育。第二,短期鎘處理促進(jìn)了河南華溪蟹肝胰腺和卵巢細(xì)胞內(nèi)的線粒體能量代謝,具體表現(xiàn)為應(yīng)激反應(yīng)。該反應(yīng)有利于機體內(nèi)脂肪酸的合成,并緩解脂質(zhì)過氧化作用對細(xì)胞膜的損傷；但是,隨著染毒時間的延長,河南華溪蟹組織細(xì)胞內(nèi)的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,參與能量合成代謝關(guān)鍵酶的活性降低、能量合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)受到抑制。表明鎘阻礙了線粒體的呼吸鏈,最終影響了組織內(nèi)的能量合成,并造成機體內(nèi)ATP供應(yīng)受阻。第三,短期鎘處理,對河南華溪蟹組織內(nèi)的NADPH合成有促進(jìn)作用,誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)還原力的生成。同時GSH合成速率升高,細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力和抗鎘脅迫能量加強；長期鎘處理,則會抑制組織中還原力的生成,造成機體內(nèi)還原型谷胱甘肽含量降低、抗氧化水平減弱,最終影響體內(nèi)脂肪物質(zhì)的生物合成。第四,鎘抑制了河南華溪蟹肝胰腺和卵巢組織內(nèi)Vg-mRNA的表達(dá)。通過自身代謝補償機制導(dǎo)致糖類、脂肪等物質(zhì)大量減少,引起組織內(nèi)Vn積累量的降低,最終導(dǎo)致卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞直徑降低。表明鎘影響了卵母細(xì)胞的成熟并可能對卵子發(fā)生產(chǎn)生抑制作用。第五,本研究結(jié)果,可以作為深入研究河南華溪蟹生殖調(diào)控和鎘污染毒性評估的重要理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：河南華溪蟹 脂肪代謝 卵黃磷蛋白 線粒體能量代謝 鎘
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S945
【目錄】：

• 中文摘要10-14
• 英文摘要14-19
• 第一章 綜述19-29
• 1 鎘的污染來源及現(xiàn)狀19-22
• 2 鎘的生物蓄積與毒性研究22-25
• 2.1 鎘的生物蓄積22-23
• 2.2 鎘對生物有機體組織器官代謝生理功能的影響23-24
• 2.3 鎘的毒理機制24-25
• 3 本學(xué)位論文的研究內(nèi)容和研究意義25-29
• 第二章 鎘對河南華溪蟹脂肪積累與代謝的影響29-41
• 摘要29-31
• 1 材料與方法31-32
• 1.1 實驗材料31
• 1.2 實驗方法31-32
• 1.3 數(shù)據(jù)分析32
• 2 結(jié)果32-37
• 2.1 水體和河南華溪蟹肝胰腺和卵巢組織中鎘的含量32-34
• 2.2 鎘對河南華溪蟹卵巢和肝胰腺脂肪含量、淋巴液甘油三酯含量及肝胰腺與卵巢指數(shù)的影響34-35
• 2.3 鎘對河南華溪蟹脂肪消化與轉(zhuǎn)運及合成代謝的影響35-37
• 3 討論37-39
• 4 小結(jié)39-40
• 英文摘要40-41
• 第三章 鎘對河南華溪蟹線粒體能量代謝的影響41-59
• 摘要41-43
• 1 材料與方法43-47
• 1.1 實驗材料43-44
• 1.2 實驗方法44-47
• 1.3 數(shù)據(jù)分析47
• 2 結(jié)果47-55
• 2.1 鎘對河南華溪蟹肝胰腺和卵巢NADH和NAD含量及線粒體膜電位的影響47
• 2.2 鎘對河南華溪蟹肝胰腺和卵巢ATP和ADP含量的影響47-49
• 2.3 鎘對河南華溪蟹肝胰腺組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響49-53
• 2.4 鎘對河南華溪蟹肝胰腺和卵巢能量代謝相關(guān)酶活性及mRNA表達(dá)的影響53-55
• 3 討論55-57
• 4 小結(jié)57-58
• 英文摘要58-59
• 第四章 鎘對河南華溪蟹NADPH合成代謝的影響59-75
• 摘要59-61
• 1 材料與方法61-64
• 1.1 實驗材料61-62
• 1.2 實驗方法62-64
• 1.3 數(shù)據(jù)分析64
• 2 結(jié)果64-71
• 2.1 鎘對河南華溪蟹肝胰腺和卵巢NADPH、NADP~+含量的影響64-65
• 2.2 鎘對河南華溪蟹肝胰腺和卵巢NADPH依賴酶活性的影響65-67
• 2.3 鎘對河南華溪蟹肝胰腺和卵巢谷胱甘肽含量和谷胱甘肽還原酶(GR)活性的影響67
• 2.4 鎘對河南華溪蟹肝胰腺和卵巢金屬硫蛋白含量及mRNA表達(dá)的影響67-70
• 2.5 鎘對河南華溪蟹肝胰腺和卵巢丙二醛含量的影響70-71
• 3 討論71-73
• 4 小結(jié)73-74
• 英文摘要74-75
• 第五章 鎘對河南華溪蟹卵黃磷蛋白合成的影響75-104
• 摘要75-77
• 1 材料與方法77-83
• 1.1 實驗材料77-78
• 1.2 實驗方法78-82
• 1.2.1 卵黃磷蛋白原基因序列來源與生物信息學(xué)分析78-79
• 1.2.2 半定量PCR法檢測Vg基因在河南華溪蟹各組織中的mRNA表達(dá)79-80
• 1.2.3 卵黃磷蛋白分離、純化及ELISA法建立80-81
• 1.2.4 樣本染毒處理及取樣81-82
• 1.2.5 河南華溪蟹卵母細(xì)胞直徑及組織內(nèi)卵黃磷蛋白含量測定82
• 1.2.6 河南華溪蟹組織內(nèi)卵黃磷蛋白原(Vg)基因mRNA表達(dá)水平檢測82
• 1.2.7 河南華溪蟹組織內(nèi)糖類及蛋白代謝檢測82
• 1.3 數(shù)據(jù)分析82-83
• 2 結(jié)果83-98
• 2.1 河南華溪蟹卵黃磷蛋白原基因的克隆83
• 2.2 卵黃磷蛋白基因的全長核苷酸序列及氨基酸序列83-86
• 2.3 卵黃磷蛋白基因的生物信息學(xué)分析86-89
• 2.4 卵黃磷蛋白原基因在河南華溪蟹不同組織的表達(dá)89-90
• 2.5 卵黃磷蛋白分離、純化及ELISA法的建立90-94
• 2.6 鎘對河南華溪蟹卵母細(xì)胞直徑,肝胰腺、卵巢和淋巴液Vn含量的影響94-96
• 2.7 鎘對河南華溪蟹肝胰腺和卵巢糖原含量與蛋白質(zhì)代謝的影響96-98
• 3 討論98-100
• 4 小結(jié)100-102
• 英文摘要102-104
• 參考文獻(xiàn)104-120
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果120-122
• 致謝122-124
• 個人簡況及聯(lián)系方式124-125
• 承諾書125-126

  本文關(guān)鍵詞：鎘對河南華溪蟹脂肪積累與代謝的影響及毒性機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：350802