本文關(guān)鍵詞：大麥條紋花葉病毒TGB1蛋白磷酸化修飾在病毒侵染和運(yùn)動(dòng)中的功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：大麥條紋花葉病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV)是大麥病毒屬(Hordeivirus)的典型成員,其編碼的TGB1是一個(gè)多功能運(yùn)動(dòng)蛋白,具有RNA結(jié)合、RNA解旋酶和自身互作等功能。TGB1通過與TGB3蛋白的直接互作、與TGB2蛋白的間接作用來實(shí)現(xiàn)病毒的胞間運(yùn)動(dòng)。同時(shí),TGB1蛋白還是BSMV對短柄草(Brachypodium distachyon)的致病決定因子,ND18株系(NDBSMV)編碼的NDTGB1蛋白可被短柄草的R基因Bsrl識別并誘發(fā)抗性反應(yīng)。然而,關(guān)于BSMV TGB1蛋白的磷酸化修飾尚未見報(bào)道。 以BSMV新疆株系(XJBSMV)為研究對象,利用磷酸化特異抗體檢測XJBSMV侵染的本生煙葉片、原核表達(dá)純化的xjTGB1蛋白為底物的體外磷酸化等方法確定了XJTGB1蛋白在體內(nèi)和體外均能被激酶CK2磷酸化。通過軟件預(yù)測、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析(LC-MS/MS)、XJTGB1及其突變體蛋白的體外磷酸化實(shí)驗(yàn),證明了其主要磷酸化位點(diǎn)為第401位的蘇氨酸(Thr-401),并首次揭示第395位的蘇氨酸(Thr-395)是CK2激酶的磷酸化錨定位點(diǎn)(docking site)。以XJBSMV的侵染性克隆為骨架,將Thr-395和Thr-401位點(diǎn)進(jìn)行不同的點(diǎn)突變并接種大麥、小麥和本生煙,結(jié)果表明,與野生型病毒相比,各突變體病毒的致病性和侵染效率均有不同程度的下降。通過觀察和比較各突變體病毒的胞間運(yùn)動(dòng)情況,證明了部分突變體系統(tǒng)侵染能力的喪失主要是由于病毒的胞間運(yùn)動(dòng)受到明顯抑制所致。GST pull-down的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,磷酸化是通過影響TGB1和TGB3蛋白的互作來調(diào)節(jié)TGB1運(yùn)動(dòng)蛋白的功能,進(jìn)而影響病毒的侵染性。 XJBSMV能系統(tǒng)侵染玉米自交系B73,而NDBSMV則不能,為了確定BSMV不同株系對B73的致病關(guān)鍵因子,通過NDBSMV和XJBSMV不同RNA組分的重配和RNAβ的片段重組,并對玉米進(jìn)行摩擦接種實(shí)驗(yàn),證實(shí)XJBSMV對B73的致病關(guān)鍵因子為RNAp編碼的XJTGB1蛋白,通過定點(diǎn)突變進(jìn)一步將致病關(guān)鍵氨基酸定位到403位的谷氨酸(Glu-403)。鑒于TGB1蛋白的磷酸化修飾對病毒運(yùn)動(dòng)的調(diào)控作用,在探究TGB1作為玉米致病關(guān)鍵因子機(jī)制的過程中,利用原核表達(dá)純化了NDTGB1和XJTGB1蛋白在Glu-403位點(diǎn)以及磷酸化位點(diǎn)的各種突變體蛋白,比較并分析這些蛋白被玉米CK2激酶的磷酸化程度。同時(shí),以NDBSMV和XJBSMV的侵染性克隆為骨架,構(gòu)建相應(yīng)的突變體并對玉米進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,突變體蛋白的磷酸化水平與相應(yīng)突變體病毒的侵染性之間并未呈現(xiàn)嚴(yán)格的正相關(guān),說明TGB1蛋白的磷酸化修飾與XJBSMV對玉米的致病性沒有直接的關(guān)聯(lián),可能有其它寄主因子的參與。 為了進(jìn)一步研究BSMV的致病性分化,構(gòu)建了BSMV部分株系的侵染性克隆。同時(shí),以本實(shí)驗(yàn)室收集和保存的BSMV六種株系為毒源,通過汁液摩擦或農(nóng)桿菌浸潤的方法分別接種玉米、谷子、高粱、普通煙和本生煙。結(jié)果顯示,BSMV不同株系對不同寄主上的致病性差異較大,BSMV對本生煙的致病力可能是由RNAβ和RNAγ共同決定的。這些結(jié)果為分析BSMV在不同寄主上的致病性分化以及病毒侵染機(jī)制提供了新的參考數(shù)據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：大麥條紋花葉病毒 TGB1蛋白 磷酸化修飾 CK2激酶 致病決定因子
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S435.121.4
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 縮略詞表7-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-37
• 1.1 植物病毒蛋白的磷酸化及其對病毒侵染的調(diào)節(jié)作用11-31
• 1.2 大麥條紋花葉病毒及其對不同寄主的致病性差異31-36
• 1.3 本論文的研究目的和意義36-37
• 第二章 材料與方法37-51
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料37-38
• 2.2 試劑配制38-43
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法43-51
• 第三章 xJBSMV TGB1蛋白的磷酸化對病毒致病性的影響51-77
• 3.1 TGB1蛋白的原核表達(dá)、純化及其抗體制備51-55
• 3.2 _(XJ)TGB1蛋白的體內(nèi)磷酸化(In vivo phosphorylation)55-56
• 3.3 _(XJ)TGB1蛋白的體外磷酸化(In vitro phosphorylation)56-58
• 3.4 蛋白激酶2(CK2)對_(XJ)TGB1蛋白的磷酸化驗(yàn)證58-65
• 3.5 _(XJ)TGB1蛋白的磷酸化對BSMV病毒致病性的作用及機(jī)制65-75
• 3.6 小結(jié)與討論75-77
• 第四章 BSMV不同株系對玉米的致病性差異及機(jī)制分析77-96
• 4.1 BSMV各株系對玉米的致病性差異77-80
• 4.2 TGB1蛋白是BSMV對玉米B73致病的關(guān)鍵因子80-85
• 4.3 _(XJ)BSMV磷酸化位點(diǎn)突變體對玉米的致病性研究85-87
• 4.4 _(ND)BSMV磷酸化位點(diǎn)突變體對大麥和玉米的致病性87-89
• 4.5 _(ND)TGB1和_(XJ)TGB1蛋白上致病關(guān)鍵位點(diǎn)突變體的磷酸化89-94
• 4.6 小結(jié)與討論94-96
• 第五章 BSMV對不同寄主植物的侵染性研究96-113
• 5.1 BSMV各株系對不同寄主的侵染性研究96-101
• 5.2 BSMV不同株系侵染性克隆的構(gòu)建101-103
• 5.3 BSMV各株系侵染性克隆對本生煙的致病性驗(yàn)證103-104
• 5.4 BSMV各株系對本生煙的致病力差異分析104-108
• 5.5 小結(jié)與討論108-113
• 結(jié)論與展望113-114
• 參考文獻(xiàn)114-124
• 致謝124-126
• 個(gè)人簡歷126-128
• 附錄 引物列表128-132

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 彭學(xué)賢,蔡發(fā)興,孫薇,莽克強(qiáng);大麥條紋花葉病毒新疆分離物是三組分RNA病毒[J];病毒學(xué)報(bào);1986年03期

2 于善謙;王鳴岐;陳仲宜;張若平;;種傳大小麥病毒病的研究(Ⅰ)——大麥條紋花葉病毒在我國的證實(shí)[J];復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1980年04期

  本文關(guān)鍵詞：大麥條紋花葉病毒TGB1蛋白磷酸化修飾在病毒侵染和運(yùn)動(dòng)中的功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：350799