本文關(guān)鍵詞：氟脅迫對(duì)不同抗性家蠶腸道微生態(tài)環(huán)境的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：養(yǎng)蠶業(yè)在我國是農(nóng)業(yè)組成的一部分并且已經(jīng)有5000多年的歷史,在人類經(jīng)濟(jì)生活和飼養(yǎng)史中占有重要位置。家蠶(Bombyx mori L.)是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲,其重要性不僅是能夠生產(chǎn)蠶絲還由于蠶蛹自身擁有豐富的營養(yǎng)成分而具有重要價(jià)值。目前,我國有超過10個(gè)省的上千萬人參與養(yǎng)蠶業(yè)或相關(guān)的行業(yè)中。氟元素廣泛的存在于自然界中,當(dāng)家蠶攝入氟元素過量時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡。近年來,由于多種生態(tài)因素會(huì)使桑葉受到污染,如含氟廢棄物、工業(yè)生產(chǎn)后的含氟排放物和水源受氟污染等,進(jìn)而導(dǎo)致區(qū)域性家蠶氟中毒事件時(shí)有發(fā)生,嚴(yán)重的影響了養(yǎng)蠶業(yè)的經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)。氟離子是原生質(zhì)毒劑,屬于胃毒,其最初在家蠶中腸內(nèi)累積而后進(jìn)入血液及其它組織器官,因此其能夠嚴(yán)重的破壞中腸組織。中腸不但具有消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的功能還具有防御有毒有害物質(zhì)和病原微生物入侵等作用。家蠶腸道內(nèi)廣泛多樣的微生物組成了腸道微生態(tài)系統(tǒng),其是中腸的天然保護(hù)屏障并且對(duì)促進(jìn)氟離子排泄具有重要作用。氟脅迫后家蠶中腸的理化指標(biāo)和腸道微環(huán)境會(huì)發(fā)生改變進(jìn)而影響腸道微生物菌群的組成,因此研究家蠶腸道微生態(tài)環(huán)境的變化與自身耐氟性的相互關(guān)系具有重要的意義。本文主要研究結(jié)果如下:1.氟脅迫對(duì)不同抗性家蠶相關(guān)理化指標(biāo)的影響通過對(duì)不同抗性家蠶品種T6和734的氟脅迫處理,檢測其中腸和血液中總超氧化物歧化酶(SOD)酶活力、總膽固醇(TC)和甘油三脂(TG)含量、腸道內(nèi)容物水分和p H值、以及短鏈脂肪酸(SCFAs)含量的變化。氟脅迫后在T6試驗(yàn)組血漿中總SOD酶活力分別為對(duì)照組的0.53倍、2.49倍和2.66倍;734試驗(yàn)組血漿中總SOD酶活力分別為對(duì)照組的0.79倍、1.70倍和2.01倍。在T6試驗(yàn)組中腸組織中總SOD酶活力分別為對(duì)照組的0.93倍、1.23倍和1.36倍;734試驗(yàn)組中腸組織中總SOD酶活力分別為對(duì)照組的1.43倍、0.83倍和0.54倍。T6試驗(yàn)組血清中膽固醇含量分別為對(duì)照組的0.88倍、0.56倍和0.33倍,家蠶734試驗(yàn)組中膽固醇含量分別為對(duì)照組的0.64倍、0.45倍和0.18倍。T6試驗(yàn)組血清中甘油三脂含量分別是對(duì)照組的0.57倍、0.63倍和0.74倍,而家蠶734試驗(yàn)組血清中甘油三脂含量分別是對(duì)照組的0.82倍、0.73倍和0.60倍。氟脅迫對(duì)家蠶T6和734腸道內(nèi)容物中的水分含量無顯著性影響;而對(duì)家蠶734腸道內(nèi)p H值有顯著影響(P0.05),其腸道內(nèi)p H值由9.76±0.07下降到8.57±0.14。氟脅迫對(duì)家蠶腸道內(nèi)容物中幾種短鏈脂肪酸含量的影響均達(dá)到顯著性差異(P0.05),并且對(duì)主要短鏈脂肪酸乙酸、丙酸和丁酸的影響最為明顯。以上結(jié)果表明氟脅迫對(duì)家蠶多項(xiàng)理化指標(biāo)均有影響且對(duì)中腸的影響作用更大。2.氟脅迫對(duì)不同抗性家蠶中腸蛋白質(zhì)表達(dá)的影響蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要行使功能者,本研究利用雙向電泳技術(shù)(two dimensional electrophoresis,2-DE)配合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)檢測氟脅迫后家蠶中腸蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。試驗(yàn)通過篩選去除重復(fù)蛋白點(diǎn)及不可信蛋白點(diǎn)后共得到23個(gè)差異蛋白點(diǎn),利用KEGG分析找出他們所參與的代謝通路。通過分析表明這些蛋白點(diǎn)主要參與糖代謝,再利用q RT-PCR技術(shù)檢測其中V-ATPase subunit A、V-ATPase subunit B、Enolase、Aldose Reductase等蛋白點(diǎn)基因的表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn)這4個(gè)蛋白點(diǎn)基因的表達(dá)量在氟脅迫后不同抗性家蠶體中腸內(nèi)均會(huì)受到抑制作用,這說明氟脅迫會(huì)影響家蠶正常的生理活動(dòng)可能是家蠶致死的關(guān)鍵因素之一。3.氟脅迫對(duì)不同抗性家蠶腸道內(nèi)產(chǎn)消化酶菌群組成結(jié)構(gòu)的影響腸道微生物能夠產(chǎn)生多種酶類,其中有大量的胞外消化酶如酪蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和淀粉酶等,這些酶能夠促進(jìn)家蠶對(duì)桑葉中營養(yǎng)成分的消化吸收。本研究利用微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)合篩選培養(yǎng)基鑒定氟脅迫后不同抗性家蠶腸道內(nèi)產(chǎn)消化酶菌群結(jié)構(gòu)和產(chǎn)酶類型,有助于了解氟脅迫對(duì)不同抗性家蠶腸道菌群營養(yǎng)型的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示:家蠶腸道內(nèi)產(chǎn)消化酶細(xì)菌主要屬于厚壁菌門Firmicutes和變形菌門Proteobacteria,氟化物能夠降低家蠶腸道內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量并且對(duì)734達(dá)到顯著性影響(P0.05)。氟脅迫后家蠶T6腸道內(nèi)的產(chǎn)酶菌組成和消化酶種類沒有明顯變化;而家蠶734腸道內(nèi)的產(chǎn)酶菌組成和消化酶種類變的單一,主要為產(chǎn)脂肪酶的葡萄球菌屬Staphylococcus細(xì)菌。這說明氟脅迫能夠改變家蠶734腸道內(nèi)的微環(huán)境從而不利于腸道內(nèi)某些產(chǎn)消化酶細(xì)菌的定植,并且通過對(duì)產(chǎn)消化酶細(xì)菌組成的改變來影響家蠶對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收類型。4.氟脅迫對(duì)不同抗性家蠶腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群的影響家蠶腸道內(nèi)定居著大量微生物,這些微生物組成了腸道微生態(tài)系統(tǒng)。本研究利用PCR擴(kuò)增家蠶腸道細(xì)菌16S r RNA基因構(gòu)建克隆文庫并用核糖體DNA限制性分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA)方法對(duì)克隆子分型。從家蠶T6和734腸道樣品中共獲得14種分類操作單元(operational taxonomic unit,OTUs),以16S r RNA基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建發(fā)育樹進(jìn)行分析。再經(jīng)巢式PCR(nest PCR)和變形梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技術(shù)檢測家蠶腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群的變化。結(jié)果顯示:不同抗性家蠶腸道微生物的香農(nóng)維爾指數(shù)(Shannon-Wiener index)變化趨勢(shì)不同,家蠶734腸道微生物受氟化物的影響更大。氟脅迫后家蠶腸道內(nèi)的腸球菌屬Enterococcus和芽孢桿菌屬Bacillus細(xì)菌菌群減少,而葡萄球菌屬Staphylococcus的細(xì)菌增多。這說明氟脅迫能夠通過改變家蠶腸道內(nèi)細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群和菌群比例從而破壞家蠶腸道微生物區(qū)系的平衡。5.氟脅迫對(duì)不同抗性家蠶腸道微生物多樣性的影響高通量測序是近幾年研究宏基因組的流行技術(shù)手段。本研究利用Illumina Miseq測序平臺(tái)研究氟脅迫對(duì)不同抗性家蠶腸道微生物的OTU數(shù)量、組成、相似性、以及α和β-多樣性的影響。家蠶734-T組的OUT數(shù)和Shannon-Wiener index與家蠶T6達(dá)到顯著差異(P0.05),而Chao 1指數(shù)與其余幾組均達(dá)到顯著差異(P0.05)。腸道微生物菌群組成上T6-T與T6-C基本相同,而734-T與734-C的組成則明顯不同。734-T組的奇古菌門Thaumarchaeota、綠彎菌門Chloroflexi、廣古菌門Euryachaeota和未分類菌unclasified明顯增多,而Firmicutes門細(xì)菌則明顯減少,其主要減少的為Enterococcus、Lactococcus和Bacillus幾屬細(xì)菌。通過對(duì)腸道菌群的聚類分析表明T6-C與T6-T組的腸道菌群關(guān)系最近然后是734-C,距離最遠(yuǎn)的是734-T的腸道菌。在PCo A主坐標(biāo)分析中,在T6-C、T6-T和734-C組的9個(gè)樣品空間距離較近,而與734-T組的3個(gè)樣品距離較遠(yuǎn)這與聚類分析結(jié)果相似。氟脅迫能夠明顯改變家蠶734腸道內(nèi)的宏基因組,并且腸道微生物菌群的動(dòng)態(tài)變化和古菌的出現(xiàn)與其自身對(duì)氟化物的耐受性相關(guān)。6.耐氟枯草芽孢桿菌SWL-19的篩選鑒定及益生效果研究益生菌是指一類對(duì)宿主健康其促進(jìn)作用并具有多種生物活性的活體微生物。本研究利用高溫選育法對(duì)家蠶腸道內(nèi)的芽孢桿菌進(jìn)行初篩,以產(chǎn)多種胞外消化酶和能富集氟離子的特性為基礎(chǔ),結(jié)合溶血試驗(yàn)、抗生素藥敏試驗(yàn)和產(chǎn)消化酶能力大小等對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行復(fù)篩。通過形態(tài)、生理生化特征和16S r RNA序列分析鑒定菌種,再利用添食飼喂法研究其對(duì)氟脅迫家蠶的益生效果。通過初篩和復(fù)篩得到一株Bacillus sbutilis SWL-19,其細(xì)胞大小為0.7~0.9×2.8~3.2μm、能產(chǎn)多種胞外消化酶、對(duì)大多數(shù)抗生素敏感、無溶血性、具有革蘭氏染色陽性和產(chǎn)芽孢等生理生化特征,與Bacillus subtilis strain YQH 60(HQ143659.1)有100%的同源性。SWL-19能耐受1600 mg/kg氟離子濃度,并且在含100 mg/kg氟化物的培養(yǎng)基中其富集系數(shù)為78.4。通過對(duì)氟脅迫家蠶734添食該菌后可顯著性(P0.05)提高蠶體重和降低死亡率。以上試驗(yàn)表明:枯草芽孢桿菌SWL-19能明顯減輕氟脅迫對(duì)家蠶的影響,證實(shí)利用微生物提高家蠶對(duì)氟化物的抗性是可行的,為蠶業(yè)生產(chǎn)中氟中毒事件提供一種可行應(yīng)對(duì)策略和解決方法。
【關(guān)鍵詞】：家蠶 氟脅迫 腸道微生態(tài) 中腸 益生效果
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S881.2
【目錄】：

• 摘要8-11
• Abstract11-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-27
• 1.1 蠶桑氟脅迫中毒研究概述15-17
• 1.1.1 氟元素的性質(zhì)及污染來源15-16
• 1.1.2 氟化物對(duì)桑葉的危害16
• 1.1.3 氟化物對(duì)家蠶的危害16-17
• 1.2 家蠶腸道及雙向電泳技術(shù)的研究17-19
• 1.2.1 家蠶腸道研究近況17-18
• 1.2.2 雙向電泳技術(shù)18-19
• 1.3 腸道菌群的研究概述19-26
• 1.3.1 腸道菌群與動(dòng)物免疫之間的相互關(guān)系19-21
• 1.3.2 腸道菌群對(duì)動(dòng)物腸黏膜免疫的調(diào)控影響21-26
• 1.4 益生菌對(duì)腸道菌群的影響及飼用微生態(tài)制劑的研究26-27
• 第二章 引言27-31
• 2.1 研究意義27
• 2.2 研究內(nèi)容27-29
• 2.3 技術(shù)路線29-31
• 第三章 氟脅迫對(duì)不同抗性家蠶相關(guān)理化指標(biāo)的影響31-45
• 3.1 材料與方法31-36
• 3.1.1 試驗(yàn)材料31
• 3.1.2 主要試劑藥品、儀器及溶液配置31-33
• 3.1.3 試驗(yàn)方法33-36
• 3.2 結(jié)果與分析36-41
• 3.2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活力36-37
• 3.2.2 膽固醇（Cholesterol）和甘油三脂（Triglyceride）的含量37-38
• 3.2.3 氟脅迫對(duì)家蠶腸道內(nèi)容物的影響38-39
• 3.2.4 氟脅迫對(duì)家蠶腸道短鏈脂肪酸（SCFAs）的影響39-41
• 3.3 討論41-45
• 第四章 脅迫對(duì)不同抗性家蠶中腸蛋白質(zhì)組的影響45-59
• 4.1 材料和方法45-52
• 4.1.1 試驗(yàn)材料45
• 4.1.2 主要試劑藥品、儀器及溶液配置45-47
• 4.1.3 試驗(yàn)方法47-52
• 4.2 結(jié)果與分析52-57
• 4.2.1 不同抗性家蠶中腸組織的蛋白質(zhì)定量及SDS-PAGE電泳52
• 4.2.2 不同抗性家蠶中腸組織蛋白雙向凝膠電泳分析52-53
• 4.2.3 差異表達(dá)蛋白的MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定53-56
• 4.2.4 差異表達(dá)蛋白的KEGG分析56
• 4.2.5 4 種差異表達(dá)蛋白基因的熒光定量分析分析56-57
• 4.3 討論57-59
• 第五章 氟脅迫對(duì)不同抗性家蠶腸道內(nèi)產(chǎn)消化酶菌群組成結(jié)構(gòu)的影響59-71
• 5.1 材料和方法59-64
• 5.1.1 試驗(yàn)材料59
• 5.1.2 主要試劑藥品、儀器及溶液配置59-61
• 5.1.3 試驗(yàn)方法61-64
• 5.2 結(jié)果與分析64-68
• 5.2.1 家蠶腸道細(xì)菌的形態(tài)觀察及分離純化64
• 5.2.2 家蠶腸道細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)64
• 5.2.3 家蠶腸道細(xì)菌產(chǎn)消化酶種類檢測64-68
• 5.3 討論68-71
• 第六章 氟脅迫對(duì)不同抗性家蠶腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群的影響71-84
• 6.1 材料和方法71-74
• 6.1.1 試驗(yàn)材料71
• 6.1.2 主要試劑藥品、儀器及溶液配置71-73
• 6.1.3 試驗(yàn)方法73-74
• 6.2 結(jié)果與分析74-81
• 6.2.1 腸道細(xì)菌基因組DNA提取和 16S RNA序列擴(kuò)增74
• 6.2.2 家蠶腸道細(xì)菌多樣性的克隆文庫分析74-78
• 6.2.3 家蠶腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群的PCR-DGGE分析78-81
• 6.3 討論81-84
• 第七章 高通量測序分析氟脅迫對(duì)不同抗性家蠶腸道微生物多樣性的影響84-96
• 7.1 材料和方法84-87
• 7.1.1 試驗(yàn)材料84
• 7.1.2 主要試劑藥品、儀器及溶液配置84-85
• 7.1.3 試驗(yàn)方法85-87
• 7.2 結(jié)果與分析87-93
• 7.2.1 氟脅迫后家蠶腸道菌群OTUs的Venn關(guān)系、稀疏和累積曲線87-88
• 7.2.2 氟脅迫對(duì)不同抗性家蠶腸道菌群多樣性的影響88-89
• 7.2.3 氟脅迫對(duì)不同抗性家蠶腸道菌群組成的影響89-91
• 7.2.4 氟脅迫對(duì)不同抗性家蠶腸道菌群的聚類分析和PCoA分析91-93
• 7.3 討論93-96
• 第八章 耐氟枯草芽孢桿菌SWL-19的篩選鑒定及益生效果研究96-108
• 8.1 材料和方法96-99
• 8.1.1 試驗(yàn)材料96
• 8.1.2 主要試劑藥品、儀器及溶液配置96-98
• 8.1.3 試驗(yàn)方法98-99
• 8.2 結(jié)果與分析99-106
• 8.2.1 枯草芽孢桿菌SWL-19的篩選99-100
• 8.2.2 枯草芽孢桿菌SWL-19的鑒定及保存100-103
• 8.2.3 菌株對(duì)氟的耐受性及吸收特性103-104
• 8.2.4 枯草芽孢桿菌SWL-19對(duì)氟脅迫后家蠶的益生效果研究104-106
• 8.3 討論106-108
• 第九章 全文總結(jié)108-112
• 論文創(chuàng)新點(diǎn)112-114
• 參考文獻(xiàn)114-128
• 在讀期間發(fā)表的論文及參加的課題128-129
• 已申請(qǐng)的專利129
• 主持與參加的課題129-130
• 致謝130-131

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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5 李冠楠;夏雪娟;Parfait Sendegeya;趙歡歡;隆耀航;朱勇;;氟化物對(duì)家蠶腸道微生物菌群的影響[J];微生物學(xué)報(bào);2015年07期

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