CRISPR/Cas9技術(shù)自問世以來一直受到廣泛的關(guān)注�？蒲腥藛T建立了各個物種的CRISPR/Cas9系統(tǒng);對系統(tǒng)的編輯效率、范圍和編輯類型及多基因編輯等方面進行了優(yōu)化;并且利用該系統(tǒng)實現(xiàn)了多物種的基因功能鑒定和品種改良等工作。而CRISPR/Cpf1技術(shù)是不同于CRISPR/Cas9的一種新的基因編輯技術(shù)。本研究論文主要建立了水稻農(nóng)桿菌介導的CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)、擴展了CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的編輯范圍、提高了系統(tǒng)的編輯效率并利用該系統(tǒng)實現(xiàn)了高效的多基因編輯。主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下:1、獲得了水稻密碼子優(yōu)化的Os Lb Cpf1基因序列,構(gòu)建了p HUN 611表達載體,選取了Os PDS和Os BEL基因作為靶基因,合成了不同長度的cr RNA,構(gòu)建了6個靶標載體。農(nóng)桿菌介導水稻穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化獲得T0植株,對T0植株進行陽性檢測、T7E1檢測和測序檢測,獲得了T0代突變植株。統(tǒng)計植株突變率得到cr RNA類型依次是Matrue cr RNA、Pre-cr RNA type I、Pre-cr RNA type II時,Os PDS基因的突變率分別為:0%、13.6%和2... 

【文章來源】：安徽農(nóng)業(yè)大學安徽省

【文章頁數(shù)】：111 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

TALEN靶向基因方法

安徽農(nóng)業(yè)大學博士學位論文第一章文獻綜述4示。圖1-2CRISPR/Cas系統(tǒng)類型IIFig.1-2ThetypeIIofCRISPR/Cas1.2.3CRISPR/Cas系統(tǒng)類型II的作用機制CRISPR/Cas系統(tǒng)類型II在發(fā)揮作用時，除了CRISPR簇和Cas蛋白的參與外，還需要有crRNA和tracrRNA的參與[35-37]。在此類型中，發(fā)揮重要作用的是Cas9蛋白。Cas9蛋白不僅可以生產(chǎn)加工crRNA，而且可以切割外源DNA雙鏈[38]。在細菌中，CRISPR/Cas系統(tǒng)由tracrRNA、crRNA、RNaseIII復合體以及Cas9蛋白組成。在細菌體內(nèi)發(fā)揮免疫功能的分子機制大致可分為三步：第一步，對外源DNA的識別。細菌通過其識別外源DNA上的特殊片段——PAM，即原型間隔序列毗鄰基序（protospacer-associationmotif），識別外源DNA。識別之后將PAM毗鄰的間隔序列整合到細菌的基因組CRISPR序列中；第二步，crRNAs的形成。pre-crRNA由CRISPR簇轉(zhuǎn)錄而來，產(chǎn)生的pre-crRNA與tracrRNA，即trans-activatingcrRNA，結(jié)合形成復合體[34]。在Cas9的幫助下，該復合體被細菌自身的RNaseIII切割而成為成熟的crRNAs；第三步：CRISPR/Cas系統(tǒng)對外源DNA的切割。CrRNA、tracrRNA與Cas蛋白組成了一個三元復合體，在這個三元復合體的作用下，外源DNA雙鏈首先被解鏈，一條鏈與crRNA鏈互補，另一條鏈游離在細菌體內(nèi)。此時Cas9蛋白的兩個功能位點，HNH位點對互補鏈實行剪切、而RuvC位點對非互補鏈實行剪切[39]，從而實現(xiàn)對外源DNA雙鏈剪切，造成外源DNA在細菌體內(nèi)的降解，發(fā)揮細菌的免疫功能。因為細菌的CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)類型II所需的參與物質(zhì)相對較少，所以研究者將類型II進

安徽農(nóng)業(yè)大學博士學位論文第一章文獻綜述5行人為的改造，而使其可以應用于真核生物的靶向基因編輯[40-42]。真核生物體內(nèi)含有內(nèi)源性的RNA酶，從而在利用該系統(tǒng)時無需額外加入RNA酶[43]。為了使利用過程更加簡單易行，科研工作者根據(jù)tracrRNA和crRNA的結(jié)構(gòu)特性，設計出與其二聚體結(jié)構(gòu)相似的單鏈引導RNA(sgRNA)。sgRNA同樣可以特異的與Cas9蛋白相結(jié)合，并且引導其到特定的靶位點來實現(xiàn)DNA雙鏈的剪切。最終實驗室所利用的CRISPR/Cas系統(tǒng)是同時含有sgRNA識別域及Cas9蛋白剪切域的復合體（圖1-3）。利用這一系統(tǒng)只需要在靶位點的設計時注意最后位點的PAM序列要求為NGG，即可實現(xiàn)幾乎所有基因組的定向打靶。圖1-3用于真核生物的CRISPR/Cas系統(tǒng)Fig.1-3TheCRISPR/Cassystemforeukaryon1.2.4CRISPR/Cas技術(shù)介導的基因突變CRISPR/Cas技術(shù)自從問世以來就得到廣泛關(guān)注。在不到兩年的時間里已經(jīng)成功的應用于酵母等小型真核生物，果蠅[41]、斑馬魚[44]等動物以及擬南芥[45,46]、水稻[45]、小麥[47]等植物的靶向基因編輯。Jienk等[21]首次證明了CRISPR/Cas可以靶向任意DNA序列。2013年1月，Cong等[40]分別成功構(gòu)建了兩種不同類型的II型CRISPR/Cas系統(tǒng)，除此以外還證明了Cas9蛋白在短RNA復合體的指導下可以特異性的實現(xiàn)對人細胞和小鼠細胞DNA雙鏈的剪切。Hwang等[48]人工優(yōu)化的sgRNA指導的CRISPR/Cas系統(tǒng)成功地實現(xiàn)了斑馬魚胚胎中定點的DNA雙鏈切割，通過該系統(tǒng)地作用，可以引起斑馬魚細胞中fh1、apoea等基因的定點突變，而且其突變效率與利用TALEN技術(shù)相當。Wang等[49]同樣利用該技術(shù)在

【參考文獻】：
期刊論文
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[3]Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cpf1 system[J]. Xixun Hu,Chun Wang,Qing Liu,Yaping Fu,Kejian Wang.  Journal of Genetics and Genomics. 2017(01)
[4]Rapid improvement of grain weight via highly efficient CRISPR/Cas9-mediated multiplex genome editing in rice[J]. Rongfang Xu,Yachun Yang,Ruiying Qin,Hao Li,Chunhong Qiu,Li Li,Pengcheng Wei,Jianbo Yang.  Journal of Genetics and Genomics. 2016(08)



本文編號：3143076