【摘要】：mi RNAs(micro RNAs)是普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)的一類內(nèi)源保守非編碼小分子RNA,mi RNA和AGO蛋白結(jié)合形成RISC復(fù)合物,在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)其靶基因m RNA進(jìn)行剪切或翻譯抑制,從而調(diào)控靶基因的表達(dá)水平。mi RNA參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、開花結(jié)果、衰老、死亡及對(duì)非生物、生物逆境脅迫響應(yīng)等。枳(Poncirus trifoliata)是柑橘近緣屬,抗寒性強(qiáng),但枳中響應(yīng)低溫的mi RNAs卻很少有研究。本研究采用高通量測(cè)序、生物信息學(xué)分析等技術(shù)挖掘枳低溫相關(guān)mi RNAs,研究這些mi RNAs與其靶基因在枳應(yīng)答低溫脅迫中的功能。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.以低溫4℃馴化3d(CA)和未馴化(Control)的枳葉片進(jìn)行高通量小分子RNA測(cè)序。對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析,共鑒定出107個(gè)保守mi RNAs,分別屬于44個(gè)mi RNA家族,有36個(gè)mi RNAs響應(yīng)低溫脅迫,其中14個(gè)mi RNAs在其它物種中未見有參與低溫脅迫的報(bào)道。此外,預(yù)測(cè)了5個(gè)新mi RNAs。靶基因多數(shù)是轉(zhuǎn)錄因子,實(shí)時(shí)定量驗(yàn)證了mi RNAs表達(dá)與測(cè)序結(jié)果一致。2.在柑橘不抗寒類型檸檬中超表達(dá)ptf-mi R396b前體基因MIR396b,成熟ptf-mi R396b表達(dá)水平在轉(zhuǎn)基因檸檬中大幅提高,且轉(zhuǎn)基因檸檬相比野生型表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗寒性,組織化學(xué)染色和生理指標(biāo)測(cè)定也證實(shí)了轉(zhuǎn)基因檸檬的抗寒性增強(qiáng)。5’-RACE和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化證實(shí)Ptr ACO是ptf-mi R396b的靶基因,兩者在枳響應(yīng)低溫脅迫中具有相反的表達(dá)模式。實(shí)驗(yàn)證明ptf-mi R396b上調(diào)抑制Ptr ACO表達(dá),進(jìn)而抑制了乙烯合成,同時(shí)多胺合成相關(guān)基因被誘導(dǎo)上調(diào),多胺含量積累量升高。轉(zhuǎn)基因檸檬低溫處理后,Ptr ACO表達(dá)水平比野生型更低,乙烯釋放量低于野生型,乙烯和多胺合成的共同底物SAM更多地進(jìn)入多胺合成途徑,多胺合成相關(guān)基因表達(dá)水平及多胺積累量均高于野生型。ptf-mi R396b通過調(diào)節(jié)其靶基因Ptr ACO的表達(dá)水平維持乙烯和多胺合成平衡,從而調(diào)控枳對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)。3.本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新的ptf-mi Rn02和ptf-mi Rn04產(chǎn)生于同一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的兩條臂上,且ptf-mi Rn04的測(cè)序豐度比ptf-mi Rn02高,ptf-mi Rn02可能是ptf-mi Rn04的mi RNA*,本章克隆鑒定了枳ptr-mi Rn04及ptr-mi Rn02的成熟序列和前體序列,預(yù)測(cè)ptf-mi Rn04的靶基因是Ptr FBA基因,該基因參與糖代謝且與ptr-mi Rn04的表達(dá)水平呈反向相關(guān),在煙草中超表達(dá)ptf-mi Rn04前體基因降低了煙草的抗寒性,ptf-mi Rn04在低溫脅迫響應(yīng)中是一個(gè)負(fù)調(diào)控因子。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S666

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2798873