【摘要】：新疆紅肉蘋果是新疆野蘋果的變型,是我國珍貴的野生果樹資源,其枝、葉、花、果均為紅色,美麗鮮艷,并且果實(shí)中富含花青苷和多酚等抗氧化物質(zhì),具有較高的觀賞價(jià)值和豐富的醫(yī)療保健功能,但其肉質(zhì)多松軟,汁少,風(fēng)味甜、淡甜或甜酸略有澀味,果實(shí)品質(zhì)有待改良。為此,本課題組于2006年在國內(nèi)率先構(gòu)建了新疆紅肉蘋果和富士等栽培蘋果雜交群體。本研究以新疆紅肉蘋果雜交群體為試材,針對雜交后代紅色性狀的遺傳基礎(chǔ)不明確、紅綠性狀分離規(guī)律不清楚、紅肉蘋果愈傷組織培養(yǎng)及體細(xì)胞無性系變異等問題展開了相關(guān)研究,旨在明確蘋果紅色性狀遺傳規(guī)律和發(fā)育機(jī)理,為新疆紅肉蘋果的育種和開發(fā)利用提供理論支持。主要研究結(jié)果如下:1.在雜交后代紅色單株中克隆到MdMYB10基因,其cDNA編碼序列(CDS)與MdMYB10_Maypole(AB744002)序列完全一致,與MdMYB1_Golden Delicious(DQ886415)和MdMYBA_Tsugaru(AB279598)同源性均為99%;其啟動(dòng)子序列,與MdMYB10_niedzwetzkyana(EU518250)同源性為99%,也含有R6重復(fù)序列,與MdMYB1_Golden Delicious(DQ886415)啟動(dòng)子序列同源性也高達(dá)98%。2.對F1分離群體中8個(gè)紅色單株和8個(gè)綠色單株及‘紫紅1號’和‘紅富士’回交BC1群體中95個(gè)紅色單株和5個(gè)綠色單株MdMYB10位點(diǎn)基因型進(jìn)行了PCR鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MdMYB10基因?yàn)榧t色單株特有。3.MdMYB10/MdMYB10×MdMYB1/MdMYB1雜交組合后代基本全為紅色(95%),但有5%左右的綠色類型。MdMYB1/MdMYB10×MdMYB1/MdMYB1的12個(gè)雜交組合間紅綠分離比存在差異,總體為0.6:1,其中2個(gè)雜交組合紅綠分離比接近1:1,分別為0.89:1和0.83:1;但3個(gè)雜交組合紅綠分離比僅約0.2:1。對MdMYB10/MdMYB10×MdMYB1/MdMYB1雜交組合后代中9個(gè)綠色單株進(jìn)行了SSR鑒定,其中有6個(gè)綠色單株能夠確認(rèn)為雜種。證明紅色性狀是由MdMYB10基因控制的顯性性狀,但MdMYB10位點(diǎn)可能存在某種突變機(jī)制。4.用紅色優(yōu)株‘紫紅3號’葉片誘導(dǎo)了紅色愈傷組織,通過液相質(zhì)譜聯(lián)用鑒定出3種花青苷,分別是矢車菊-3-半乳糖苷、矢車菊-3-阿拉伯糖苷和矢車菊-3-木糖苷,其中矢車菊-3-半乳糖苷含量最多,占總峰面積的94%以上。NAA 0.3mg/L+6-BA 1.0mg/L為花青苷誘導(dǎo)的最佳激素組合,3%蔗糖是最適合作為紅肉蘋果愈傷組織培養(yǎng)的糖源,低氮有利于紅肉蘋果愈傷組織花青苷的積累但抑制愈傷組織的生長,缺氮條件下花青苷含量最高可達(dá)2mg/g。生長素抑制花青苷的合成,低濃度下愈傷組織為紅色,但在高濃度下變?yōu)辄S色。細(xì)胞分裂素在一定濃度范圍內(nèi)促進(jìn)愈傷組織花青苷合成,但超過最適濃度,產(chǎn)生抑制。細(xì)胞分裂素與生長素一起用對花青苷合成的促進(jìn)作用大于單用細(xì)胞分裂素,說明生長素和細(xì)胞分裂素在調(diào)控花青苷合成上有互作。5.研究了紅色愈傷組織和黃色愈傷組織中花青苷合成相關(guān)基因(MdCHS、MdCHI、MdF3H、MdDFR、MdLDOX、MdUFGT、MdMYB10、MdbHLH3和MdTTG1)的表達(dá)差異,結(jié)果表明除了MdTTG1,其它基因在紅色愈傷組織中表達(dá)量均高于黃色愈傷組織。進(jìn)一步研究表明,紅肉蘋果愈傷組織在0.25 mg/L 2,4-D處理后2h能快速響應(yīng)生長素信號抑制花青苷合成基因的表達(dá)。6.研究了紅色愈傷組織和黃色愈傷組織中生長素信號途徑ARF和IAA基因家族成員的表達(dá)差異,篩選到12個(gè)差異表達(dá)的IAA基因和13個(gè)ARF基因,進(jìn)一步通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明MdARF3和MdARF4蛋白可以與MdMYB10蛋白互作。7.以紅色愈傷組織和黃色愈傷組織為試材,進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序,分析了黃色愈傷組織相對于紅色愈傷組織的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAA和2,4-D處理分別有2,515和3,052個(gè)差異表達(dá)基因(log2 ratio≥2且P≤0.0001),其中花青苷代謝途徑及苯丙氨酸代謝其它支路上結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)均被抑制,花青苷和原花青素向液泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的基因表達(dá)也被抑制,參與花青苷合成調(diào)控的MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量均被下調(diào)。生長素信號途徑有9個(gè)AUX/IAA家族基因和7個(gè)ARF家族基因的表達(dá)被高濃度NAA和2,4-D共同上調(diào)。高濃度NAA和2,4-D共引起了42個(gè)MYBs、17個(gè)bHLHs、17個(gè)WRKYs、17個(gè)NACs、6個(gè)bZIPs、4個(gè)TCPs、16個(gè)Homeoboxs、9個(gè)HSFs、2個(gè)G2-likes和4個(gè)SBPs轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá),廣泛參與了細(xì)胞的生理代謝,并且影響了細(xì)胞分裂素、乙烯及赤霉素等其它激素信號途徑基因表達(dá),說明生長素對花青苷代謝的調(diào)控是多途徑共同參與的結(jié)果。8.在紅肉蘋果組織培養(yǎng)再生過程中發(fā)現(xiàn)一株綠色突變體,花青苷含量顯著低于紅色組培苗。SSR證明綠色突變體確實(shí)來源于紅色組培苗�；ㄇ嘬蘸铣山Y(jié)構(gòu)基因表達(dá)量在綠色突變體中均低于紅色組培苗,調(diào)控基因MdMYB10表達(dá)量紅色組培苗是綠色突變體的6倍。對MdMYB10位點(diǎn)基因型鑒定并結(jié)合測序結(jié)果表明,綠色突變體是由于MdMYB10基因的缺失突變造成的。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S661.1

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本文編號：2796256