【摘要】：絨山羊的絨毛具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,毛囊性狀對(duì)絨毛產(chǎn)量和品質(zhì)有十分重要的影響。近年來(lái),有關(guān)絨山羊毛囊周期性生長(zhǎng)的分子調(diào)控機(jī)理取得較大的研究進(jìn)展,但毛囊在胚胎期啟動(dòng)、生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的分子調(diào)控機(jī)理相關(guān)研究還相對(duì)匱乏。目前,生命科學(xué)研究進(jìn)入了后基因組時(shí)代,轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)是功能基因組學(xué)研究的重要內(nèi)容,同時(shí)也為研究毛囊生長(zhǎng)發(fā)育分子作用機(jī)制提供了很好的途徑。本研究采集了絨山羊10個(gè)不同時(shí)期的胎兒皮膚,根據(jù)前期研究結(jié)果對(duì)45天(d)、55天(d)和65天(d)的絨山羊胎兒(E45,E55和E65)體側(cè)皮膚(相同時(shí)期的3個(gè)樣本作為生物學(xué)重復(fù))進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和蛋白組測(cè)序,分別采用熒光定量PCR(qPCR)和蛋白免疫印跡(Western blot, WB)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,并對(duì)兩組學(xué)數(shù)據(jù)聯(lián)合分析發(fā)掘與絨山羊胚胎期毛囊啟動(dòng)、生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因、蛋白,為研究絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生、發(fā)育分子調(diào)控機(jī)理提供研究基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：1.通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共測(cè)得平均每個(gè)樣品11G的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)量,差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)時(shí)期差異表達(dá)基因4581個(gè),其中E55 vs.E45有1590個(gè)差異表達(dá)基因,E65 vs.E55有2442個(gè)差異表達(dá)基因,E65 vs.E45有3844個(gè)差異表達(dá)基因(P≤0.05)。qPCR隨機(jī)檢測(cè)了10個(gè)差異基因在E45,E55和E65的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)其中8個(gè)基因的表達(dá)結(jié)果和RNA-seq一致。2.通過(guò)K-means方法分析基因表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)3個(gè)時(shí)期的4581個(gè)差異基因可以分為10類(lèi),每一類(lèi)基因在毛囊的發(fā)生發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮相近的功能；基因表達(dá)譜聚類(lèi)(Hierarchical clustering)分析,發(fā)現(xiàn)E55和E45表達(dá)譜相近。GO功能分析發(fā)現(xiàn)差異基因顯著富集在細(xì)胞成分,分子功能和生物過(guò)程等方面(P0.05)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)部分差異基因注釋在WNT、TGFβ和ECM受體相互作用等通路中,存在于這些通路的重要差異基因可作為絨山羊毛囊發(fā)生、發(fā)育關(guān)鍵候選基因。通過(guò)高通量測(cè)序分析了3個(gè)時(shí)期9個(gè)樣品的可變剪接類(lèi)型,包括A5SS, A3SS, ES和IR,其中最普遍的剪切事件為IR。3.檢測(cè)毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵候選基因SFRP4, WNT3, WNT10a和APC2在胎兒期10個(gè)不同階段的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)這4個(gè)基因在E45,E55和E65的表達(dá)與RNA-seq一致,進(jìn)一步驗(yàn)證了RNA-seq結(jié)果準(zhǔn)確性的同時(shí),初步探討了Wnt轉(zhuǎn)導(dǎo)通路差異基因在絨山羊毛囊在胚胎期啟動(dòng)、生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程可能發(fā)揮的作用。4.通過(guò)ITRAQ鑒定到E45,E55和E653個(gè)時(shí)期胎兒皮膚共有蛋白質(zhì)1172個(gè),差異蛋白質(zhì)378個(gè),其中E55 vs.E45有143個(gè)差異蛋白質(zhì),E65 vs. E55有176個(gè)差異蛋白,E65 vs.E45有201個(gè)差異蛋白(P0.05)。利用WB技術(shù)檢測(cè)Decorin蛋白在E45,E55和E65的表達(dá),結(jié)果與ITRAQ一致。5.GO富集分析發(fā)現(xiàn),差異蛋白在屬于細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程和生物學(xué)調(diào)節(jié)等的生物學(xué)過(guò)程中富集；分子功能屬性上,在結(jié)合和催化活性等過(guò)程富集;細(xì)胞組分屬性上,在細(xì)胞和細(xì)胞器富集較多差異蛋白質(zhì)。KEGG分析發(fā)現(xiàn)部分差異蛋白質(zhì)注釋到ECMR interaction, Focal adhesion, PI3K-Akt, MAPK, TGF-beta, VEGF、WNT和p53等信號(hào)通路中。用Cluser 3.0對(duì)隨著胎兒發(fā)育表達(dá)量顯著差異質(zhì)的188個(gè)蛋白進(jìn)行聚類(lèi)分析(P0.05),發(fā)現(xiàn)其中159個(gè)差異蛋白質(zhì)表現(xiàn)出3種明顯的變化趨勢(shì),其中63個(gè)蛋白質(zhì)在整個(gè)檢測(cè)時(shí)期持續(xù)上升,45個(gè)蛋白質(zhì)持續(xù)下降及50個(gè)蛋白質(zhì)呈先上升后下降趨勢(shì)。6.轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)后兩個(gè)時(shí)期共同差異上調(diào)基因238個(gè),下調(diào)表達(dá)基因920個(gè),胎兒55～65天發(fā)育階段比胎兒45～55天發(fā)育階段差異上調(diào)表達(dá)585個(gè)基因,下調(diào)表達(dá)1348個(gè)差異基因。發(fā)現(xiàn)后兩個(gè)時(shí)期共同差異上調(diào)蛋白31個(gè),下調(diào)表達(dá)蛋白28個(gè),胎兒55～65天發(fā)育階段比胎兒45～55天發(fā)育階段差異上調(diào)表達(dá)69個(gè)蛋白,下調(diào)表達(dá)96個(gè)差異蛋白。其中,部分基因如DCN,KRT7, OXCT1, MYH10和ANPEP等的RNA-seq和ITRAQ測(cè)序數(shù)據(jù)在3個(gè)胎兒時(shí)期中的變化趨勢(shì)一致。7.對(duì)Decorin(DCN)在絨山羊胎兒皮膚10個(gè)時(shí)期的mRNA和蛋白的表達(dá)譜進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)Decorin(DCN)在mRNA和蛋白水平上都是45天,55天和65天時(shí)表現(xiàn)持續(xù)上調(diào)趨勢(shì),75天,95天和105天皮膚中表達(dá)量相對(duì)其他胎兒時(shí)期較高,115天,125天和135天的表達(dá)量出現(xiàn)下降趨勢(shì)。8.為后期從細(xì)胞水平研究DCN基因的作用機(jī)制,構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體pEGFP-CI/DCN。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S827
【圖文】：

圖１可Y 剪接的剪接方式逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｙｐｅｓ邋ｏｆ邋ａｈｅｍａｔｉｖｅ邋ｓｐｌｉｃｉｎｇ逡逑．５．２轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（ＲＮＡ－ｓｅｑ）逡逑近年來(lái)，隨著下一代高通量測(cè)序技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研巧的大量運(yùn)用，轉(zhuǎn)錄組測(cè)逡逑技術(shù)（ＲＮＡ－ｓｅｑ）己能夠全面、高效的檢測(cè)某一物種，某一特定組織、某一特定生逡逑狀態(tài)下的所有轉(zhuǎn)錄本的序列信息。對(duì)于有參考基因組序列的物種的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序逡逑程如圖２。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（ＲＮＡ－ｓｅｑ）作為一種有效檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本信息的技術(shù)，逡逑點(diǎn)有Ｗ下幾個(gè)方面：（１）該技術(shù)不需要引入特異性探針，不需要基因組信息，逡逑沒(méi)有基因組注釋的物種也能進(jìn)行分析，因此可對(duì)任意物種進(jìn)行全面的轉(zhuǎn)錄組分逡逑：（２）數(shù)字化信號(hào)，能檢測(cè)幾乎所有轉(zhuǎn)錄本信息，高覆蓋度；（３）檢測(cè)闊值跨逡逑寬，高達(dá)６個(gè)數(shù)量級(jí)：（４）可對(duì)檢測(cè)單堿基的差異，高分辨率；（５）檢測(cè)范圍逡逑，稀有的轉(zhuǎn)錄本也可進(jìn)行檢測(cè)，因此。ＲＮＡ－ｓｅｑ在檢測(cè)可變剪接（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ逡逑ｐｌｉｃｉｎｇ）邋１６３４＂、挖掘單核昔酸多態(tài)性（ＳＮＰ）邋Ｕ３’邋６Ｗ９Ｉ和簡(jiǎn)單重復(fù)序列（ＳＳＲ）邋等方逡逑

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)巧±學(xué)位論文樣本的同一蛋白質(zhì)在一級(jí)質(zhì)譜（ＭＳ＇）中，有相同的質(zhì)荷聯(lián)質(zhì)譜中，由于報(bào)告基團(tuán)、質(zhì)量平衡基團(tuán)和多r婪從帕科膠饣哦�，乃G觳獾獎(jiǎng)徊煌凰乇曇塹耐壞鞍祝保保�，１１�(dān)保保逗停保保罰模岬謀ǜ胬胱櫻ǜ胬胱擁那慷燃創(chuàng)分型桓齷蔚姆岫齲ǎ幔猓酰睿洌幔睿悖澹�，通过分畏d廡┍撲愕鞍字試誆煌芳淶謀澩锪勘戎擔(dān)簦椋住＃桑裕遙粒鴨際蹕啾齲渥畬蟮撓攀剖峭扛擼峁煽�，能同湿N治觶玻岡吹牡鞍字恃罰ㄏ赴�、讬┋、体液谍x┒寄懿捎酶梅椒槊舳戎勢(shì)滓瞧鰨ㄈ紓粒攏�，�(dān)叮埃埃誨澹裕瑁澹潁恚錚疲椋螅瑁澹潁眩牛┑鬧始ㄊ亢投烤范取＃桑裕遙粒鴨際醯娜鋇閌且遠(yuǎn)啻硨褪約練延枚冀細(xì)�。辶x

本文編號(hào)：2769319