本文關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌介導(dǎo)虎杖芪合酶基因遺傳轉(zhuǎn)化棗樹增強(qiáng)抗性的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：壺瓶棗(Zizyphus jujuba Mill.)是中國優(yōu)質(zhì)棗品種之一,但真菌性病害已嚴(yán)重制約了壺瓶棗生產(chǎn)；白藜蘆醇作為植物次生代謝產(chǎn)物不但能提高果樹抗真菌能力,還具有具有眾多的藥理和保健功能,其中最令人矚目和具有發(fā)展前景的是其抗腫瘤、心血管保護(hù)、抗氧化功能。大量研究表明,遺傳轉(zhuǎn)化STS基因能夠增強(qiáng)植物的抗真菌能力,本研究的目的為芪合酶基因遺傳轉(zhuǎn)化棗樹提高棗樹的抗真菌病害能力和改善棗的果品品質(zhì)。壺瓶棗作為山西太谷的地理標(biāo)識品種,經(jīng)濟(jì)價(jià)值高,產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景好。白藜蘆醇在虎杖根中含量較高,前期研究從虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)根中分離得到白藜蘆醇合成芪合酶關(guān)鍵基因PcPKS5(EU647245),具有高效催化合成白藜蘆醇功能。本研究通過組織培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù),對壺瓶棗優(yōu)良單株進(jìn)行組織培養(yǎng),即獲得高效莖尖和莖段誘導(dǎo)的叢生芽建立植物再生體系,構(gòu)建虎杖芪合酶基因植物表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,將虎杖白藜蘆醇生物合成關(guān)鍵基因PcPKS5遺傳轉(zhuǎn)化壺瓶棗。結(jié)果如下：(1)優(yōu)化壺瓶棗徑段誘導(dǎo)得到高分化率的叢生芽遺傳轉(zhuǎn)化體系。將壺瓶棗再生體系材料剪成0.8-1.0 cm含莖尖和莖段的外植體,農(nóng)桿菌侵染菌液中浸泡15.0min,集中置于培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天,避光培養(yǎng),轉(zhuǎn)入含Cb300 mg/L, AS 60 mg/L叢生芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-6周。將分化叢生芽轉(zhuǎn)接至含4.0mg/L Basta,5-6周檢測陽性植株,為壺瓶棗成功實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)；(2)成功將狗頭棗葉片外植體材料誘導(dǎo)出愈傷組織,并分化得到完整植株,并建立了狗頭棗葉片再生遺傳轉(zhuǎn)化體系；(3)壺瓶棗遺傳轉(zhuǎn)化材料經(jīng)Basta篩選、GUS顯色、gDNA PCR、RT-PCR等檢測證實(shí),成功獲得到3個陽性轉(zhuǎn)基因壺瓶棗株系,熒光實(shí)時(shí)定量檢測RNA瞬時(shí)表達(dá)得到其中株系2表達(dá)效率高于其他兩個株系。經(jīng)植物化學(xué)成分鑒定遺傳轉(zhuǎn)化植株中存在白藜蘆醇,研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)化植株中虎杖芪合酶在壺瓶棗異源表達(dá),目的基因表達(dá)代謝生成目標(biāo)產(chǎn)物白藜蘆醇,其鮮重含量為0.45μg/g,抑菌效果相當(dāng)于1ug/ul白藜蘆醇樣品(抑菌率平均為23.08%),具備抗真菌桃褐腐(Monilinia fructicola)真菌、棗假尾孢(Isariopsis imdica var. Ziziphi)、細(xì)交鏈孢菌[Alternaria alternate(Fr.)Keissler]的能力。同時(shí)相對野生型植株,朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus)有趨避遺傳轉(zhuǎn)化植株的現(xiàn)象發(fā)生。本研究在壺瓶棗成功遺傳轉(zhuǎn)化虎杖芪合酶基因,獲得壺瓶棗遺傳轉(zhuǎn)化新材料。且PcPKS5在棗樹中異源表達(dá),轉(zhuǎn)基因材料中能夠代謝合成白藜蘆醇,提高轉(zhuǎn)PcPKS5基因壺瓶棗抗棗樹病原真菌病能力,研究結(jié)果為發(fā)掘棗樹新的種質(zhì)資源提供技術(shù)途徑。有關(guān)壺瓶棗遺傳轉(zhuǎn)化材料是否在果實(shí)中積累,改善果品品質(zhì)仍需深入研究。
【關(guān)鍵詞】：遺傳轉(zhuǎn)化 虎杖芪合酶基因 棗樹 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 白藜蘆醇 增強(qiáng)抗性
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S665.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-14
• 1. 緒論14-30
• 1.1. 棗栽培、產(chǎn)業(yè)發(fā)展及存在需要解決的問題14
• 1.2. STS基因與遺傳轉(zhuǎn)化代謝白藜蘆醇14-19
• 1.2.1. STS基因15
• 1.2.2. 白藜蘆醇是從植物體中獲取最有前景的物質(zhì)之一15-16
• 1.2.3. 白藜蘆醇在營養(yǎng)和醫(yī)藥方面的應(yīng)用16
• 1.2.4. 白藜蘆醇在農(nóng)業(yè)方面對應(yīng)用16
• 1.2.5. 商業(yè)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法16-19
• 1.3. 芪合酶遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)例19-22
• 1.3.1. 芪合酶基因來源19
• 1.3.2. 農(nóng)作物過表達(dá)芪合酶基因19-21
• 1.3.3. 果樹基因工程研究現(xiàn)狀21-22
• 1.3.4. 棗樹基因工程遺傳轉(zhuǎn)化研究22
• 1.4. 立題依據(jù)與產(chǎn)業(yè)前景22-24
• 1.4.1. 立題依據(jù)22-24
• 1.4.2. 擬解決的關(guān)鍵問題24
• 1.5. 本研究的目的意義24-25
• 1.6. 技術(shù)路線25-26
• 1.7. 試驗(yàn)研究方法26-30
• 1.7.1. 棗樹的高效率再生體系的研究26-27
• 1.7.2. 植物表達(dá)載體構(gòu)建27
• 1.7.3. 遺傳轉(zhuǎn)化體系建立27
• 1.7.4. 遺傳轉(zhuǎn)化植株檢測27-30
• 2. 芪合酶基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建30-36
• 2.1. 材料與方法30-31
• 2.1.1. 基因及試劑30
• 2.1.2. 方法30-31
• 2.2. 結(jié)果與分析31-34
• 2.2.1. 表達(dá)載體的構(gòu)建與侵染菌株制備31-33
• 2.2.2. 構(gòu)建植物表達(dá)載體的驗(yàn)證33-34
• 2.3. 討論34
• 2.3.1. 表達(dá)載體構(gòu)建成功34
• 2.3.2. 植物表達(dá)載體的應(yīng)用前景分析34
• 2.4. 本章小結(jié)34-36
• 3. 壺瓶棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立36-48
• 3.1. 材料與方法36-39
• 3.1.1. 壺瓶棗與試劑36-37
• 3.1.2. 方法37-39
• 3.2. 結(jié)果與分析39-45
• 3.2.1. 壺瓶棗棗苗生長狀況結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析39-40
• 3.2.2. 壺瓶棗無性系生根40-41
• 3.2.3. 遺傳轉(zhuǎn)化影響因子的篩選41-43
• 3.2.4. 遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化43-45
• 3.2.5. Basta篩選遺傳轉(zhuǎn)化體系材料的獲得45
• 3.3. 討論45-46
• 3.3.1. 外植體材料的可行性分析45
• 3.3.2. 壺瓶棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立45-46
• 3.4. 本章小結(jié)46-48
• 4. 狗頭棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立48-58
• 4.1. 材料與方法48-51
• 4.1.1. 狗頭棗及試驗(yàn)試劑48
• 4.1.2. 方法48-51
• 4.2. 結(jié)果與分析51-56
• 4.2.1. 狗頭棗葉片誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基篩選51-52
• 4.2.2. 狗頭棗愈傷組織的分化52-53
• 4.2.3. 狗頭棗狗頭棗誘導(dǎo)生根53
• 4.2.4. As對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響53
• 4.2.5. 抗生素的篩選53-54
• 4.2.6. AgNO_3對愈傷組織分化的影響54
• 4.2.7. 無性系試管苗抗除草劑試驗(yàn)54-55
• 4.2.8. 狗頭棗遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化55-56
• 4.3. 討論56-57
• 4.3.1. 狗頭棗葉片再生體系的建立56-57
• 4.3.2. 再生遺傳轉(zhuǎn)化體系仍需深入研究57
• 4.4. 本章小結(jié)57-58
• 5. 轉(zhuǎn)基因材料測試驗(yàn)證58-68
• 5.1. 材料與方法59-61
• 5.1.1. 遺傳轉(zhuǎn)化材料及試劑59
• 5.1.2. 方法59-61
• 5.2. 結(jié)果與分析61-65
• 5.2.1. 陽性植株的檢測61-63
• 5.2.2. 白藜蘆醇的提取、分離與HPLC、LCMS分析63-65
• 5.3. 討論65-66
• 5.4. 本章小結(jié)66-68
• 6. 轉(zhuǎn)基因材料的抗性試驗(yàn)68-76
• 6.1. 材料與方法68-69
• 6.1.1. 遺傳轉(zhuǎn)化材料與棗病原真菌68-69
• 6.1.2. 方法69
• 6.2. 結(jié)果與分析69-73
• 6.2.1. 白藜蘆醇抑菌桃褐腐試驗(yàn)69-70
• 6.2.2. 壺瓶棗遺傳轉(zhuǎn)化材料抑菌試驗(yàn)70-72
• 6.2.3. 遺傳轉(zhuǎn)化材料抗螨蟲試驗(yàn)72-73
• 6.3. 討論73-75
• 6.4. 本章小結(jié)75-76
• 7. 結(jié)論76-80
• 7.1. 主要結(jié)果76-77
• 7.1.1. 成功構(gòu)建PcPKS5植物表達(dá)載體76
• 7.1.2. 建立和優(yōu)化棗樹再生遺傳體系76
• 7.1.3. 虎杖芪合酶基因在棗樹異源成功表達(dá)76
• 7.1.4. 轉(zhuǎn)基因遺傳棗樹材料產(chǎn)生新的抗性76-77
• 7.2. 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)77
• 7.3. 棗樹轉(zhuǎn)基因的展望與環(huán)境安全的思考77-80
• 參考文獻(xiàn)80-94
• 附錄94-96
• 個人簡介96-98
• 導(dǎo)師簡介98-100
• 成果目錄100-102
• 致謝10

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