本文關(guān)鍵詞：Viperin抑制狂犬病病毒機理的探索研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Viperin是一種干擾素誘導(dǎo)蛋白,可通過完全不同的機制對多種病毒發(fā)揮抗病毒活性。先前的研究沒有viperin抑制狂犬病病毒(RABV)復(fù)制的報道。通�？袢〔《驹谄湟赘屑毎猩L良好,具有較高的病毒滴度。最近我們的研究中發(fā)現(xiàn),狂犬病病毒在巨噬細胞RAW264.7中生長緩慢,病毒滴度顯著地低于易感細胞(如NA細胞)。進一步的研究發(fā)現(xiàn),狂犬病病毒感染易感的NA細胞時,viperin表達微弱或不表達,但感染巨噬細胞時viperin被顯著誘導(dǎo)表達。本研究為了探索抗病毒蛋白viperin的表達是否抑制狂犬病病毒的復(fù)制,我們構(gòu)建了viperin的真核表達載體,通過瞬時轉(zhuǎn)染BSR-T7細胞,過表達viperin,證實了過表達viperin能抑制狂犬病病毒rRC-HL的復(fù)制,在一定范圍內(nèi)狂犬病病毒N、P和M蛋白在細胞中的表達量明顯被抑制,狂犬病病毒滴度顯著降低。通過篩選穩(wěn)定表達viperin的BHK-21細胞系,感染狂犬病病毒,發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達viperin的BHK-21細胞系對狂犬病病毒rRC-HL株的抑制效果更加明顯,顯著抑制了病毒蛋白的合成。同樣穩(wěn)定表達viperin的BHK-21細胞系顯著抑制廣西分離強毒Ⅰ群和Ⅲ群代表株GX01和GXN119。在此基礎(chǔ)上,為了進一步探索viperin抑制狂犬病病毒主要功能區(qū)域,本實驗構(gòu)建了缺失viperin N末端兩親性的a螺旋區(qū)域及突變S-腺苷甲硫胺酸酶基序的突變體,測定這些突變體抑制狂犬病病毒的效果,結(jié)果顯示viperin的抑制狂犬病病毒復(fù)制活性區(qū)域主要位于其N末端,其突變后抗狂犬病病毒能力顯著下降。S-腺苷甲硫胺酸酶基序的3個關(guān)鍵氨基酸(C83A/C87A/C90A)突變后,其抑制狂犬病病毒的能力也明顯下降。先前的研究發(fā)現(xiàn)viperin的N末端可結(jié)合細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及脂滴,擾亂細胞膜的脂筏結(jié)構(gòu)來抑制病毒的出芽與釋放。為了探索viperin抑制狂犬病病毒復(fù)制的機理,本實驗就viperin對脂筏的重要組成成分膽固醇和鞘磷脂的生物學(xué)作用進行探索。首先在BSR-T7細胞中過表達viperin,檢測細胞中膽固醇和鞘磷脂變化情況。結(jié)果顯示,過表達viperin能夠降低細胞中膽固醇和鞘磷脂的含量,推測viperin可能通過破壞膽固醇和鞘磷脂以抑制狂犬病病毒釋放。同時添加分別抑制膽固醇和鞘磷脂的藥物MβCD和Myroicin,發(fā)現(xiàn)破壞細胞的膽固醇和鞘磷脂對狂犬病病毒的吸附與穿入無影響,但對狂犬病病毒的出芽與釋放有抑制作用,證實了破壞細胞的膽固醇和鞘磷脂是viperin抑制狂犬病病毒復(fù)制的重要途徑之一。Viperin是干擾素誘導(dǎo)蛋白,受干擾素的誘導(dǎo)和調(diào)控,本實驗進一步探索狂犬病病毒感染巨噬細胞上調(diào)viperin基因的上游信號傳導(dǎo)通路,應(yīng)用芯片技術(shù)對狂犬病病毒感染RAW264.7細胞后,84個免疫應(yīng)答基因及幾個主要看家基因轉(zhuǎn)錄譜進行了分析。結(jié)果顯示,狂犬病病毒感染巨噬細胞后12、24和36 h三個時間點都上調(diào)2倍以上的基因共有26個；12 h上調(diào)2倍以上、24和36 h無明顯變化的基因有2個；12和24 h上調(diào)2倍以上、36 h無明顯變化的基因有1個；12h無變化、24和36 h上調(diào)2倍以上的基因有15個；12和24 h無變化、36 h上調(diào)2倍以上的基因有17個；12、24和36 h三個時間點都沒有明顯變化(小于2倍)的基因有25個；12、24和36 h三個時間點都下調(diào)2倍以上的基因有1個。其中,Cxcl10基因在12、24和36 h三個時間點上調(diào)倍數(shù)分別為377.85、333.14和183.12倍；IFNβ基因分別為370.07、68.12和13.09倍�？袢〔《靖腥綬AW264.7細胞也會引起TLRs不同程度升高,TLR3基因分別為156.68、380.03和164.66倍,TLR2和TLR8基因呈一定程度的上調(diào)表達,TLR1、TLR4、TLR5、 TLR6、TLR7和TLR9也有較顯著的變化。上述實驗證明TLRs參與了狂犬病病毒感染RAW264.7細胞的免疫信號傳導(dǎo)。根據(jù)TLR4能夠識別病毒的囊膜蛋白傳遞免疫信號和激活機體固有免疫、TLR3識別雙鏈RNA (dsRNA)和病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的中間復(fù)合物的特性,本研究使用流式細胞術(shù)證明了巨噬細胞感染狂犬病病毒后,顯著上調(diào)TLR4的表達,說明狂犬病病毒激活了TLR4然而再用滅活的狂犬病病毒孵育巨噬細胞,發(fā)現(xiàn)保留了基本自然特性的狂犬病病毒囊膜糖蛋白能夠誘導(dǎo)viperin的表達。進一步用TLR4的特異性抑制劑(TAK-242)阻斷TLR4信號的傳導(dǎo),顯示viperin的表達量顯著減少,說明TLR4參與了識別狂犬病病毒并誘導(dǎo)viperin表達。為了驗證TLR3與狂犬病病毒相互作用及其誘導(dǎo)viperin表達的固有免疫反應(yīng),本實驗首先構(gòu)建了TLR3基因敲除的TLR3-/- RAW264.7細胞系,感染狂犬病病毒,檢測viperin蛋白的變化情況,顯示敲除了TLR3基因的TLR3-/- RAW264.7細胞可顯著推遲并減少viperin蛋白表達量,說明TLR3參與識別狂犬病病毒核酸并誘導(dǎo)viperin的表達。NF-κB和IRF3是固有免疫信號通路中兩個重要的免疫因子,用NF-κB的特異性抑制劑抑制其通路的信號傳導(dǎo),然后感染狂犬病病毒,結(jié)果顯示抑制NF-κB通路的信號傳導(dǎo),viperin的表達量幾乎不受影響,說明狂犬病病毒上調(diào)viperin與NF-κB信號通路沒有直接關(guān)聯(lián)性。用IRF3的特異性抑制劑格爾德霉素抑制處理細胞后,可抑制IRF3的分子伴侶Hsp90,使viperin的表達時間推遲并減少表達量,說明IRF3參與了狂犬病病毒誘導(dǎo)viperin表達的調(diào)控。綜上所述,狂犬病病毒感染巨噬細胞RAW264.7可誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)蛋白viperin表達,viperin表達具有抑制狂犬病強毒、弱毒復(fù)制的作用。這種抑制作用主要通過破壞RAW264.7細胞膜的膽固醇和鞘磷脂,阻礙病毒的出芽和釋放。進一步的芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),巨噬細胞RAW264.7感染狂犬病病毒時多數(shù)TLRs的表達受到影響。當(dāng)用狂犬病病毒感染敲除TLR3基因的TLR3-/- RAW264.7細胞,viperin的表達量比正常RAW264.7細胞顯著減少并延后；用TLR4抑制劑TAK-242可抑制狂犬病病毒誘導(dǎo)viperin的產(chǎn)生；因此,viperin的誘導(dǎo)受上游TLR3/TLR4的調(diào)控。通過系統(tǒng)研究,闡明了狂犬病病毒感染巨噬細胞RAW264.7誘導(dǎo)viperin的分子通路,具有重要的理論價值和實踐意義。
【關(guān)鍵詞】：狂犬病病毒 viperin TLR3 TLR4
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S855.3
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-20
• 第一章 文獻綜述20-36
• 1.1 狂犬病的流行病學(xué)21-22
• 1.1.1 狂犬病的全球概況21
• 1.1.2 狂犬病病毒的宿主范圍21-22
• 1.1.3 狂犬病的臨床癥狀22
• 1.2 狂犬病病毒分子結(jié)構(gòu)22
• 1.3 狂犬病的發(fā)病機制22-25
• 1.3.1 糖蛋白和致病性23-24
• 1.3.2 細胞死亡和致病性24
• 1.3.3 狂犬病病毒逃避先天免疫反應(yīng)24-25
• 1.4 狂犬病病毒感染的免疫應(yīng)答25-26
• 1.5 狂犬病病毒感染與Toll樣受體通路的免疫反應(yīng)26-30
• 1.5.1 Toll樣受體及其與狂犬病病毒的相互作用27-28
• 1.5.2 狂犬病病毒感染的免疫應(yīng)答涉及TLR728-29
• 1.5.3 狂犬病病毒感染MyD88敲除的小鼠29-30
• 1.6 Viperin30-34
• 1.6.1 Viperin的結(jié)構(gòu)與特征31
• 1.6.2 Viperin表達調(diào)控31-32
• 1.6.3 Viperin的抗病毒功能32-33
• 1.6.4 Viperin在免疫信號與免疫反應(yīng)中的作用33
• 1.6.5 病毒逃避與利用viperin33-34
• 1.7 挑戰(zhàn)與展望34-36
• 第二章 Viperin抑制狂犬病病毒的復(fù)制是通過破壞細胞膜膽固醇和鞘磷脂36-75
• 2.1 材料37-39
• 2.1.1 細胞和病毒37
• 2.1.2 質(zhì)粒37
• 2.1.3 抗體37
• 2.1.4 主要儀器37-38
• 2.1.5 主要的試劑38
• 2.1.6 引物設(shè)計與合成38-39
• 2.2 方法39-47
• 2.2.1 重組狂犬病病毒的拯救39-40
• 2.2.2 病毒效價的滴定40
• 2.2.3 不同細胞對狂犬病病毒的易感性實驗40
• 2.2.4 Western blot40-42
• 2.2.5 大腸桿菌培養(yǎng)基的配制42
• 2.2.6 制備感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α所用試劑的配制42
• 2.2.7 細胞培養(yǎng)所用溶液42
• 2.2.8 細胞或小鼠腦組織總RNA的提取42-43
• 2.2.9 QRT-PCR43-44
• 2.2.10 real-time PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化44
• 2.2.11 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作44-45
• 2.2.12 實時定量PCR實驗45
• 2.2.13 BHK-GFP或BHK-viperin-GFP細胞系構(gòu)建45
• 2.2.14 MβCD與myriocin對細胞毒性的檢測45
• 2.2.15 免疫共沉淀45-46
• 2.2.16 MβCD對細胞膽固醇、myriocin對細胞鞘磷脂降解情況46
• 2.2.17 過表達viperin對細胞膽固醇和鞘磷脂的影響試驗46-47
• 2.3 結(jié)果47-70
• 2.3.1 rRC-HL狂犬病病毒株的拯救47
• 2.3.2 狂犬病病毒效價的測定47-48
• 2.3.3 不同細胞對狂犬病病毒的易感性實驗48
• 2.3.4 狂犬病病毒感染不同細胞后viperin基因的差異表達48-51
• 2.3.5 瞬時過表達viperin抑制狂犬病病毒的復(fù)制51-54
• 2.3.6 穩(wěn)定表達viperin抑制狂犬病病毒的復(fù)制54-60
• 2.3.7 Viperin抑制狂犬病病毒復(fù)制能力與其蛋白表達量成正比60
• 2.3.8 Viperin抑制狂犬病病毒的功能區(qū)定位60-62
• 2.3.9 免疫共沉淀試驗證實viperin不結(jié)合狂犬病病毒的N、P和M蛋白62-63
• 2.3.10 過表達viperin抑制狂犬病病毒的出芽63-64
• 2.3.11 Viperin對細胞膜鞘磷脂和膽固醇的影響64-65
• 2.3.12 MβCD/Myroicin對狂犬病病毒吸附和穿入的影響65-66
• 2.3.13 MβCD/Myroicin對狂犬病病毒出芽的影響66-70
• 2.4 討論70-74
• 2.5 小結(jié)74-75
• 第三章 Viperin抑制狂犬病病毒復(fù)制受上游TLR3/4通路調(diào)控75-98
• 3.1 材料76-77
• 3.1.1 細胞/動物和病毒76
• 3.1.2 主要的試劑76
• 3.1.3 抗體76
• 3.1.4 主要儀器見2.1.476-77
• 3.2 方法77-79
• 3.2.1 細胞總RNA的提取見2.2.877
• 3.2.2 Real-time RT-PCR方法的建立見2.2.1277
• 3.2.3 Western blot見2.2.477
• 3.2.4 免疫應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄譜分析77-78
• 3.2.5 流式細胞術(shù)分析RAW264.7細胞TLR4的表達情況78
• 3.2.6 NF-kB、IRF3和TLR4的抑制試驗78
• 3.2.7 TLR3基因敲除的RAW264.7細胞系的建立78-79
• 3.3 結(jié)果79-94
• 3.3.1 狂犬病病毒感染RAW264.7細胞免疫應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄普分析79-85
• 3.3.2 TLR4對viperin的影響85-88
• 3.3.3 TLR3對viperin的影響88-89
• 3.3.4 狂犬病病毒感染對TLR3/4信號傳導(dǎo)通路相關(guān)因子的影響89-91
• 3.3.5 NF-kB信號通路對狂犬病病毒上調(diào)viperin的影響91-92
• 3.3.6 狂犬病病毒上調(diào)viperin通過IRF3/Hsp90信號通路92-94
• 3.3.7 狂犬病病毒與viperin相互作用示意圖94
• 3.4 討論94-97
• 3.5 小結(jié)97-98
• 第四章 結(jié)論98-99
• 參考文獻99-113
• 附章一：廣西狂犬病病毒GXHXN株的全基因測序及生物學(xué)特性初步研究113-137
• 摘要113-114
• ABSTRACT114-116
• 1 材料與方法116-121
• 1.1 細胞與動物116
• 1.2 單克隆抗體116-117
• 1.3 樣品117
• 1.4 引物設(shè)計與合成117-118
• 1.5 病毒RNA的提取118
• 1.6 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)118
• 1.7 測序118
• 1.8 基因序列分析118-120
• 1.9 單克隆抗體間接熒光免疫法(IFA)檢測GXHXN株N蛋白和G蛋白的抗原性120-121
• 2 結(jié)果121-132
• 2.1 樣品檢測121-122
• 2.2 GXHXN株的致病性122-124
• 2.3 GXHXN株的神經(jīng)嗜性、生長特性與GXN119比較124-125
• 2.4 GXHXN株的N和G蛋白的抗原性分析125-129
• 2.5 GXHXN的全基因測序與遺傳進化樹分析129
• 2.6 GXHXN株基因變異情況分析129-132
• 討論132-134
• 小結(jié)134-135
• 參考文獻135-137
• 附章二：拯救P-eGFP融合表達的重組狂犬病病毒株及應(yīng)用于病毒中和抗體快速檢測137-156
• 摘要137-138
• ABSTRACT138-140
• 2.1 材料與方法140-142
• 2.1.1 主要試驗材料140
• 2.1.2 構(gòu)建重組病毒的引物設(shè)計與合成140
• 2.1.3 重組質(zhì)粒pRV-eGFP的構(gòu)建140-141
• 2.1.4 重組病毒rRV-eGFP的拯救141
• 2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)RFFIT法檢測犬血清抗狂犬病毒中和抗體的主要步驟141
• 2.1.6 新型改良RFFIT-eGFP法檢測犬血清抗狂犬病毒中和抗體的主要步驟141-142
• 2.2 結(jié)果142-152
• 2.2.1 重組狂犬病病毒rRV-eGFP的感染性cDNA成功構(gòu)建142-143
• 2.2.2 重組病毒rRV-eGFP成功拯救并鑒定攜帶eGFP基因143-146
• 2.2.3 拯救重組病毒rRV-eGFP的P蛋白與eGFP蛋白融合表達146-147
• 2.2.4 重組病毒rRV-eGFP與親本毒株rRC-HL特性相似147-149
• 2.2.5 RFFIT法和RFFIT-eGFP法檢測結(jié)果的比較149-150
• 2.2.6 RFFIT-eGFP法檢測方法的優(yōu)越性150-152
• 討論152-153
• 小結(jié)153-154
• 參考文獻154-156
• 致謝156-158
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄158-159

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本文編號：264650