本文關(guān)鍵詞：DF-1細(xì)胞中禽流感病毒免疫相關(guān)基因比較分析及免疫缺陷型細(xì)胞株重構(gòu)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是從禽類中分離出來(lái)的A型流行性感冒病毒各種亞型的總稱。目前,該病毒的分離和疫苗制備仍依賴于適齡雞胚,效率低、耗能高,且不可避免地存在外源病毒的污染。因此,應(yīng)用生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行疫苗生產(chǎn)是提高疫苗質(zhì)量、降低生產(chǎn)耗能、推動(dòng)動(dòng)物疫苗制造技術(shù)升級(jí)的必由之路。禽源DF-1細(xì)胞系的建立有望替代雞胚進(jìn)行疫苗生產(chǎn),然而,該細(xì)胞系不能穩(wěn)定培養(yǎng)AIV,且病毒的抗原產(chǎn)量低于雞胚,限制了其大規(guī)模應(yīng)用。鑒于此,本研究擬采用基因修飾技術(shù)對(duì)DF-1細(xì)胞系進(jìn)行改造,以期獲得穩(wěn)定傳代的禽源轉(zhuǎn)化細(xì)胞株,提高AIV的復(fù)制能力。本研究首先比較分析了高致病性H5N1與低致病性H9N2 AIV在DF-1細(xì)胞中的復(fù)制能力,并采用定量PCR方法檢測(cè)了上述兩個(gè)亞型AIV感染DF-1細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)10個(gè)固有免疫相關(guān)基因(Mx1、OASL、ISG12、IFIT5、IFN-α、IFN-β、IRF7、USP18、SST及KHSRP)的表達(dá)差異,篩選差異表達(dá)的基因,并分析其在抗AIV感染中的功能。在此基礎(chǔ)上,分別利用mi RNA和慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)沉默干擾素受體基因(IFNAR1和IFNAR2),分析IFNAR1和IFNAR2敲低或沉默對(duì)AIV復(fù)制的影響,并篩選靶基因沉默的穩(wěn)定細(xì)胞株,以提高AIV的復(fù)制能力。結(jié)果表明:1.DF-1細(xì)胞支持H5N1和H9N2亞型AIV復(fù)制,表現(xiàn)為不同的復(fù)制能力,H5N1病毒復(fù)制能力顯著高于H9N2。分析10個(gè)固有免疫相關(guān)基因的差異性表達(dá),其中,干擾素刺激基因(Mx1、OASL、ISG12)和免疫調(diào)節(jié)基因SST應(yīng)答于H5N1與H9N2病毒感染而誘導(dǎo)相似的基因表達(dá)模式,在6 hpi或9 hpi即上調(diào)基因表達(dá),并持續(xù)至15 hpi。IFN-α和IFN-β基因在早期感染階段(3、6和9 hpi)未被顯著誘導(dǎo)表達(dá),僅在12 hpi和15 hpi時(shí)顯著上調(diào)其m RNA表達(dá),提示在病毒感染的早期階段IFN基因的表達(dá)被抑制。IFIT5與USP18基因表達(dá)模式不同于其它基因,其應(yīng)答于H9N2亞型AIV感染而持續(xù)上調(diào)表達(dá),在15 hpi達(dá)到峰值;然而,H5N1誘導(dǎo)的兩個(gè)基因在15 hpi顯著下調(diào)表達(dá),可區(qū)別DF-1細(xì)胞中兩種不同亞型的病毒感染。與上述不同的是,免疫調(diào)節(jié)基因IRF7和KHSRP顯著應(yīng)答于H9N2病毒感染,在3 hpi或6 hpi顯著上調(diào)了基因表達(dá)水平,并持續(xù)至15 hpi;然而,這兩個(gè)基因?qū)5N1病毒感染不應(yīng)答,具有亞型依賴性;且在病毒感染后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(6、9、12和15 hpi),H9N2病毒感染誘導(dǎo)的上述兩個(gè)基因m RNA表達(dá)水平顯著高于H5N1病毒,可顯著區(qū)分DF-1細(xì)胞中兩種不同亞型的AIV感染,并為深入探討IRF7和KHSRP在控制和調(diào)節(jié)不同亞型AIV復(fù)制機(jī)制方面的功能研究奠定了理論基礎(chǔ)。2.通過(guò)對(duì)IFNAR1和IFNAR2基因m RNA的定量分析,篩選得到敲低IFNAR1基因表達(dá)的重組質(zhì)粒MR-A3和敲低IFNAR2基因表達(dá)的重組質(zhì)粒MR-B2和MR-B3。3個(gè)有效mi RNA轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后下調(diào)了IFN-α和IFN-βm RNA表達(dá)水平。然而,僅MR-B2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上調(diào)了Mx1、OASL和IRF7基因m RNA的表達(dá),并促進(jìn)了AIV的復(fù)制,提示Ⅰ型IFN信號(hào)通路的激活(Mx1、OASL和IRF7基因m RNA表達(dá)的改變)可能對(duì)AIV復(fù)制起關(guān)鍵作用;而MR-A3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞抑制了AIV的復(fù)制,說(shuō)明mi RNA在基因沉默中存在非特異性作用。本實(shí)驗(yàn)雖未篩選到靶基因穩(wěn)定沉默的純化細(xì)胞株,但為后續(xù)AIV抗病毒機(jī)制研究及免疫缺陷型細(xì)胞株的構(gòu)建奠定了理論基礎(chǔ)。3.本研究設(shè)計(jì)并合成了IFNAR1和IFNAR2基因的sh RNA序列,與p LKO.1載體構(gòu)建重組質(zhì)粒,重組質(zhì)粒經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染和定量篩選,得到敲低IFANR1基因表達(dá)重組質(zhì)粒p R1-sh1、p R1-sh3和敲低IFNAR2基因表達(dá)的重組質(zhì)粒p R2-sh3。有效重組質(zhì)粒的sh RNA序列交由上海吉?jiǎng)P基因公司進(jìn)行慢病毒包裝。慢病毒以最適感染比(MOI 0.5)感染DF-1細(xì)胞,以嘌呤霉素(4μg/m L)加壓篩選并純化單克隆細(xì)胞株。選擇7株目的細(xì)胞株和1株陰性對(duì)照細(xì)胞株進(jìn)行了分析,其中5株靶向IFNAR1基因而篩選,其余兩株細(xì)胞株靶向IFNAR2基因篩選;熒光顯微鏡下觀察,分析的7株目的細(xì)胞株形態(tài)均一,純化效果好。靶向IFNAR1基因的5株細(xì)胞株中,3株(DF1-R1-sh1-3、DF1-R1-sh3-1和DF1-R1-sh3-2)顯著下調(diào)了IFNAR1 m RNA表達(dá)水平,且其中的兩株(DF1-R1-sh1-3、DF1-R1-sh3-1)在36 hpi提高了AIV的復(fù)制能力,分別提高至親本細(xì)胞的4.6倍和4.0倍。靶向IFNAR2基因的兩株細(xì)胞株均下調(diào)了IFNAR2基因m RNA表達(dá)水平,但它們對(duì)病毒的滴度無(wú)影響。本實(shí)驗(yàn)篩選得到的病毒復(fù)制能力提高的2株DF-1細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞株滿足本研究的要求�？傊�,本研究證實(shí)了IFN-α/β和ISGs應(yīng)答于H5N1和H9N2病毒感染而誘導(dǎo)不同的表達(dá)模式,并篩選到不同亞型之間顯著差異表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)基因IRF7和KHSRP。而且,本研究證實(shí)了干擾素受體基因(IFNAR1和IFNAR2)敲低或沉默能促進(jìn)AIV復(fù)制,并成功建立了兩株IFNAR1基因穩(wěn)定沉默的細(xì)胞株,提高病毒的復(fù)制滴度為親本細(xì)胞的4~5倍。本研究對(duì)深入研究AIV致病機(jī)理、推動(dòng)疫苗生產(chǎn)體系具有一定的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：DF-1細(xì)胞 禽流感 免疫相關(guān)基因 細(xì)胞株 復(fù)制
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.4
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 縮略詞表13-15
• 氨基酸的簡(jiǎn)寫符號(hào)15-16
• 第一章 研究綜述16-49
• 1. 禽流感16-22
• 2. 細(xì)胞系22-24
• 3. 宿主抗病毒應(yīng)答24-28
• 4. 免疫相關(guān)因子28-37
• 5. 細(xì)胞系構(gòu)建技術(shù)37-43
• 6. 基因表達(dá)調(diào)控研究方法及發(fā)展趨勢(shì)43-47
• 7. 本文研究目的和意義47-49
• 第二章 禽流感病毒免疫相關(guān)基因的比較分析49-70
• 1. 材料與試劑49-51
• 2. 主要儀器設(shè)備51
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法51-56
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果56-66
• 5. 討論66-68
• 6. 本章小結(jié)68-70
• 第三章 miRNA介導(dǎo)禽流感免疫缺陷型DF-1細(xì)胞系的重構(gòu)70-89
• 1. 材料與試劑71-72
• 2. 主要儀器72
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法72-79
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果79-86
• 5. 討論86-87
• 6. 本章小結(jié)87-89
• 第四章 慢病毒介導(dǎo)禽流感免疫缺陷型DF-1細(xì)胞系的重構(gòu)89-110
• 1. 材料與試劑89-90
• 2. 主要儀器90-91
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法91-99
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果99-107
• 5. 討論107-109
• 6. 本章小結(jié)109-110
• 結(jié)論110-111
• 參考文獻(xiàn)111-126
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文126-127
• 致謝127-128
• 附錄128-138

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1 任洪林;柳增善;王克堅(jiān);;鮑免疫相關(guān)基因和蛋白的研究進(jìn)展[J];遺傳;2009年04期

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4 呂愛(ài)軍;胡秀彩;朱靜榕;薛軍;王藝;程超;;弗氏檸檬酸桿菌感染誘導(dǎo)斑馬魚皮膚免疫相關(guān)基因的差異表達(dá)[J];水產(chǎn)學(xué)報(bào);2012年03期

5 楊相宜;滿朝新;劉穎;王今雨;郎友;董鑫悅;閆天文;姜毓君;;嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖對(duì)小鼠免疫相關(guān)基因的調(diào)控[J];食品科學(xué);2013年05期

6 宋曉青;邢婧;戰(zhàn)文斌;;牙鲆經(jīng)注射和浸泡免疫鰻弧菌滅活疫苗后7種免疫相關(guān)基因表達(dá)的變化[J];中國(guó)水產(chǎn)科學(xué);2014年04期

7 丁晶;王彥波;傅玲琳;;以枯草芽孢桿菌遞呈VP28對(duì)南美白對(duì)蝦免疫相關(guān)基因表達(dá)和細(xì)胞特異性吞噬的影響[J];水生生物學(xué)報(bào);2013年04期

8 董鋒;廖蘭杰;朱作言;汪亞平;;草魚免疫相關(guān)基因Prkrip1的克隆和表達(dá)分析[J];水生生物學(xué)報(bào);2013年04期

9 赫崇波;高磊;蘇浩;高祥剛;李云峰;;斑點(diǎn)叉尾銿免疫相關(guān)基因及疾病防御[J];水產(chǎn)科學(xué);2013年04期

10 彭輝;張文昌;肖天放;張涌;;Nlrp基因家族部分免疫相關(guān)基因在小鼠上的表達(dá)[J];福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2013年04期

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1 徐先棟;吳學(xué)貴;謝珍玉;王世鋒;周永燦;;LPS誘發(fā)的點(diǎn)帶石斑魚免疫相關(guān)基因鑒定、克隆與組織表達(dá)差異性分析[A];中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)魚病專業(yè)委員會(huì)2013年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2013年

2 楊舒心;雷連成;;胸膜肺炎放線桿菌菌影疫苗免疫仔豬前后差異表達(dá)基因的鑒定與分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)生物制品學(xué)分會(huì)中國(guó)微生物學(xué)會(huì)獸醫(yī)微生物學(xué)專業(yè)委員會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)（第三屆中國(guó)獸藥大會(huì)學(xué)術(shù)論壇）論文集[C];2010年

3 馬萬(wàn)山;;胃癌患者免疫相關(guān)基因的表達(dá)譜研究[A];第三屆全國(guó)臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

4 李愛(ài)芹;莊文忠;錢鳳芹;任紅梅;吳清民;;大腸桿菌免疫相關(guān)基因的克隆及其對(duì)免疫的影響[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)會(huì)分會(huì)第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2000年

5 趙雁林;端木宏謹(jǐn);李亮;;免疫相關(guān)基因在結(jié)核性肉芽組織中的表達(dá)變化分析[A];中國(guó)防癆雜志2003第25卷增刊——2003年中國(guó)防癆協(xié)會(huì)全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2003年

6 ;大會(huì)報(bào)告[A];第七屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2010年

7 趙大顯;宋述慧;王群;張曉偉;胡松年;陳立僑;;中華絨螯蟹血細(xì)胞文庫(kù)EST分析及免疫相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)[A];2008年中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2008年

8 鄭海燕;李峗;王興芬;張向蓮;王新允;;gp96與免疫相關(guān)基因CTLA-4,CD8在肺癌組織芯片中的表達(dá)及意義[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)日程及論文匯編[C];2010年

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10 楊長(zhǎng)庚;王賢麗;王磊;張博;文華;陳松林;;牙鲆PoAkirin1相互作用蛋白篩選及基因性質(zhì)的研究[A];漁業(yè)科技創(chuàng)新與發(fā)展方式轉(zhuǎn)變——2011年中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2011年

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1 劉愛(ài)玲;DF-1細(xì)胞中禽流感病毒免疫相關(guān)基因比較分析及免疫缺陷型細(xì)胞株重構(gòu)[D];山東師范大學(xué);2015年

2 杜昌升;牙鲆抗病毒及免疫相關(guān)基因的克隆鑒定及表達(dá)分析[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（水生生物研究所）;2005年

3 李朔;牙鲆免疫相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析[D];中國(guó)海洋大學(xué);2009年

4 趙雁林;免疫相關(guān)基因在結(jié)核病和肺癌患者中的表達(dá)變化分析[D];北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;2003年

5 董小寶;擬南芥免疫相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及多尺度的比較分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 蘇建明;草魚腸道組織消減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及免疫相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

7 黃菁;豬PRV感染PK15差異表達(dá)miRNAs的功能探索及3個(gè)免疫相關(guān)基因的分子特征研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

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1 張振男;不同脆化階段草魚免疫機(jī)能的變化與調(diào)控[D];上海海洋大學(xué);2015年

2 柏盈盈;鯉免疫相關(guān)基因的挖掘及芯片構(gòu)建[D];上海海洋大學(xué);2013年

3 李青梅;多個(gè)免疫相關(guān)基因在草魚中腎的表達(dá)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

4 朱艷菊;家蠶腸道免疫相關(guān)基因的篩選與鑒定[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

5 吳宗凡;厭氧芽孢桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)草魚免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

6 宋曉青;注射和浸泡免疫疫苗后牙鲆免疫相關(guān)基因表達(dá)的變化研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2014年

7 王藝;葡萄球菌誘導(dǎo)斑馬魚皮膚免疫相關(guān)基因差異表達(dá)的研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

8 趙明;免疫基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和評(píng)估及在豬抗病育種高通量數(shù)據(jù)分析中的初步應(yīng)用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

9 王博;家蠶免疫相關(guān)基因BmMyD88的功能初探[D];西南大學(xué);2011年

10 侯金蓮;雞IBV感染對(duì)氣管黏膜固有免疫相關(guān)基因表達(dá)影響初步研究[D];廣西大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：265338