本文關(guān)鍵詞：我國部分種雞群REV感染血清學(xué)調(diào)查與亞單位疫苗探索，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒感染不僅能夠引起雞發(fā)生腫瘤和嚴(yán)重的免疫抑制,還常常污染弱毒疫苗,并可通過垂直傳播造成雞群禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒較高的感染率。目前除了檢測(cè)和淘汰外,尚無有效商品化疫苗可以用于禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒的控制。此外,在科學(xué)研究中,由于禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒與人的獲得性免疫缺陷綜合征病毒具有非常相似的基因組結(jié)構(gòu),還常常被用于作為一種模式病毒來研究逆轉(zhuǎn)錄病毒的分子生物學(xué)機(jī)制特征,如病毒的準(zhǔn)種演變機(jī)制等。為了摸清我國大型種雞場(chǎng)和某些地方品系雞中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒的流行狀況,本研究利用血清學(xué)方法調(diào)查了我國部分大型種雞場(chǎng)的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒的感染情況,并通過某一特定雞群觀察了禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒在雞群中的準(zhǔn)種多樣性,對(duì)于禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒亞單位疫苗的研制做了嘗試和探索。摘要如下:1.我國部分種雞場(chǎng)REV感染的血清學(xué)調(diào)查為了調(diào)查我國部分大型種雞場(chǎng)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒感染的狀況,本研究從我國4個(gè)曾祖代雞場(chǎng)采集了536份血清樣本,從8個(gè)祖代雞場(chǎng)采集了6557份血清樣品,從4個(gè)父母代雞場(chǎng)采集了312份血清樣品,對(duì)列入我國地方品系雞保種基因庫的20種地方品系雞共采集了1306份血清樣品。所有采集的血清樣品采用ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)REV抗體,對(duì)出現(xiàn)讀數(shù)但判定為陰性的輔助IFA進(jìn)行檢測(cè),以評(píng)估這些大型種雞場(chǎng)的REV感染狀況。結(jié)果顯示在曾祖代、祖代和父母代中所檢測(cè)的REV抗體陽性率分別為0-31%,0-47%,4.23-42.50%。地方品系雞總計(jì)1306份血清樣品中有高達(dá)746份血清樣品經(jīng)ELISA和IFA檢測(cè)均為REV抗體陽性,抗體陽性率為57.12%;所有雞群均有不同程度的感染,陽性率最高達(dá)到100%�；诂F(xiàn)有數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),種雞群隨著代次的升高感染率顯著降低,不同代次的外來品系種雞感染率顯著高于地方品種,種雞開產(chǎn)前感染率高于開產(chǎn)后感染率。外來品系經(jīng)ELISA鑒定為陽性的血清樣品經(jīng)IFA鑒定均為陽性,但是某些經(jīng)ELISA檢測(cè)其讀數(shù)的OD值在臨界值附近的血清樣品經(jīng)IFA檢測(cè)可見典型的綠色熒光,也可判定為REV抗體陽性,顯示IFA比ELISA在REV抗體結(jié)果判定上靈敏度更高一些。本調(diào)查表明,RVE感染在我國某些大型種禽場(chǎng)中是比較普遍的,在我國傳統(tǒng)的地方品系基因庫中感染尤其嚴(yán)重,應(yīng)該引起高度重視。2.同一雞群不同個(gè)體中REV的分離鑒定與準(zhǔn)種多樣性比較對(duì)某雞場(chǎng)發(fā)生腫瘤病例的某海蘭褐種雞群隨機(jī)抽取8只雞,無菌采集抗凝血接種雞胚成纖維細(xì)胞和DF-1細(xì)胞進(jìn)行針對(duì)MDV、ALV和REV的分離和鑒定,最終分離到4株REV野毒,分別定名為HB1201、HB1202、HB1203、HB1204。對(duì)4株REV進(jìn)行env基因的擴(kuò)增和克隆,每個(gè)毒株選取10個(gè)陽性克隆子進(jìn)行測(cè)序和序列分析,以env基因分析和比較4個(gè)毒株的準(zhǔn)種差異。檢測(cè)發(fā)現(xiàn),HB1201-HB1204四個(gè)毒株的env基因全長(zhǎng)均為1761bp,編碼587個(gè)氨基酸,4個(gè)毒株其env基因的10個(gè)克隆子之間核酸同源性分別為99.6%-100%、99.7%-100%、99.7%-100%、99.7%-100%,其準(zhǔn)種群體中優(yōu)勢(shì)變種比例分別為20%(4/10)、30%(3/10)、60%(6/10)、30%(3/10),顯示不同個(gè)體感染REV后優(yōu)勢(shì)變種比例具有明顯差異。對(duì)4個(gè)毒株的優(yōu)勢(shì)變種分析發(fā)現(xiàn),HB1201、HB1202、HB1203的三個(gè)毒株的優(yōu)勢(shì)變種env基因相互之間為100%同源,表明這3只雞感染REV后的優(yōu)勢(shì)變種是一致的,但比例有所差異;HB1204與上述3株REV相比其優(yōu)勢(shì)變種的env基因共有2個(gè)核酸位點(diǎn)發(fā)生了變化并引起了2個(gè)推導(dǎo)氨基酸位點(diǎn)的改變,顯示同一雞群中REV的優(yōu)勢(shì)變種在不同個(gè)體中發(fā)生了變化。通過對(duì)4個(gè)毒株的優(yōu)勢(shì)變種與以前不同年份發(fā)表的參考序列比較發(fā)現(xiàn),env基因同源性在94.7%-100%之間,說明REV優(yōu)勢(shì)變種穩(wěn)定性總體較高,但準(zhǔn)種群體內(nèi)仍發(fā)生變異,保持動(dòng)態(tài)變化。3.REV-env蛋白與不同C3d分子串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建及亞單位疫探索為了探索研制能夠有效誘發(fā)雞體REV中和抗體的REV亞單位疫苗,本研究通過計(jì)算機(jī)軟件模擬并選取了禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒env基因一段抗原決定簇集中的1050bp的片段作為抗原蛋白目標(biāo)基因。為了增強(qiáng)其免疫效果,本研究利用RT-PCR的方法從雞肝臟中擴(kuò)增獲得雞C3d基因,并分別將2,3和4個(gè)C3d分子與雞網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒env-1050片段連接,經(jīng)Eco R I/Xho I雙酶切后與原核表達(dá)載體PET-30a連接構(gòu)建了禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒env蛋白與不同C3d分子串聯(lián)表達(dá)的原核表達(dá)載體,經(jīng)過SDS-PAGE和Western blot鑒定結(jié)果均顯示PET-30a-env-1050、PET-env-1050-2C3d和PET-env-1050-3C3d均獲得成功表達(dá),但PET-env-1050-4C3d未能表達(dá),可能是由于片段較長(zhǎng)的原因。鎳柱親和純化結(jié)果顯示純化蛋白符合預(yù)期大小,純度約為90%。本研究將REV env-1050分別與2,3和4個(gè)C3d分子連接,經(jīng)Eco R I/Xho I雙酶切后與表達(dá)載體p CDNA-FLAG連接構(gòu)建了禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒env-1050與不同C3d分子串聯(lián)表達(dá)的真核表達(dá)載體,SDS-PAGE和Western blot結(jié)果均顯示構(gòu)建的真核表達(dá)載體p CDNA-FLAG-env-1050、p CDNA-FLAG-1050-2C3d、p CDNA-FLAG-env-1050-3C3d和p CDNA-FLAG-env-1050-4C3d均獲得了成功表達(dá)。將上述原核表達(dá)蛋白和真核表達(dá)蛋白經(jīng)純化后分別各免疫10只15周齡SPF雞,二次免疫后三周開始采集血清,應(yīng)用禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒和IFA方法分別檢測(cè)血清中抗體,連續(xù)觀察5周,結(jié)果顯示除p CDNA-FLAG-env-1050-4C3d表達(dá)蛋白免疫組有2只雞呈現(xiàn)抗體陽性外,其他均為陰性。本研究顯示僅使用部分抗原基因片段,即使有多個(gè)C3d的免疫增強(qiáng)作用,其免疫效果也是有限的。
【關(guān)鍵詞】：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒 血清學(xué)調(diào)查 準(zhǔn)種 C3d
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.31
【目錄】：

• 中文摘要12-15
• ABSTRACT15-17
• 1 前言17-40
• 1.1 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒研究進(jìn)展17-28
• 1.1.1 REV病原學(xué)17-21
• 1.1.1.1 病毒基因組結(jié)構(gòu)及功能介紹17-20
• 1.1.1.2 REV的復(fù)制20-21
• 1.1.2 REV的分類21-22
• 1.1.3 REV的致病性22-24
• 1.1.4 REV的流行病學(xué)24-25
• 1.1.4.1 宿主24
• 1.1.4.2 病毒的傳播24-25
• 1.1.5 REV診斷25-28
• 1.1.5.1 病毒分離26
• 1.1.5.2 血清學(xué)檢測(cè)26-27
• 1.1.5.3 鑒別診斷27-28
• 1.1.6 預(yù)防控制28
• 1.1.6.1 免疫接種28
• 1.1.6.2 治療措施28
• 1.1.6.3 防控措施28
• 1.2 病毒的準(zhǔn)種及其演變28-33
• 1.2.1 準(zhǔn)種的基本特性29-30
• 1.2.2 準(zhǔn)種的作用與意義30
• 1.2.3 準(zhǔn)種的研究方法30-31
• 1.2.3.1 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析30
• 1.2.3.2 單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析30-31
• 1.2.3.3 異源雙鏈泳動(dòng)分析法31
• 1.2.3.4 毛細(xì)管電泳法31
• 1.2.3.5 PCR-質(zhì)�？寺�-序列比對(duì)分析31
• 1.2.4 病毒準(zhǔn)種的產(chǎn)生及其在不同選擇壓力下的演變31-33
• 1.2.5 REV對(duì)HIV研究的模式作用33
• 1.3 核酸疫苗與分子免疫佐劑33-40
• 1.3.1 核酸疫苗研究進(jìn)展情況33-35
• 1.3.1.1 定義33
• 1.3.1.2 核酸疫苗構(gòu)成33
• 1.3.1.3 核酸疫苗分類33-34
• 1.3.1.4 核酸疫苗的作用機(jī)制34-35
• 1.3.1.5 核酸疫苗接種方法和途徑35
• 1.3.1.6 接種劑量35
• 1.3.2 分子佐劑補(bǔ)體C3D研究進(jìn)展35-40
• 1.3.2.1 C3D的分子佐劑作用35-37
• 1.3.2.2 C3D對(duì)體液免疫應(yīng)答的影響37-38
• 1.3.2.3 C3D對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響38
• 1.3.2.4 C3D對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)類型的影響38
• 1.3.2.5 對(duì)抗原特異性體液和細(xì)胞免疫的負(fù)向調(diào)節(jié)作用38-39
• 1.3.2.6 C3D分子間的直接串聯(lián)39
• 1.3.2.7 小鼠品系對(duì)C3D免疫作用的影響39-40
• 1.3.2.8 不同動(dòng)物C3D的研究40
• 2 材料與方法40-69
• 2.1 試驗(yàn)材料40-45
• 2.1.1 雞胚、細(xì)胞與毒株40
• 2.1.2 單克隆抗體與標(biāo)記抗體40
• 2.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)試劑及耗材40
• 2.1.4 檢測(cè)試劑盒40-41
• 2.1.5 分子生物試劑41
• 2.1.6 常規(guī)試劑41
• 2.1.7 常規(guī)溶液的配制41-43
• 2.1.8 原核表達(dá)載體與真核表達(dá)載體43-44
• 2.1.9 主要儀器設(shè)備44-45
• 2.2 試驗(yàn)方法45-69
• 2.2.1 我國部分種雞場(chǎng)血清樣品的采集與保存45-46
• 2.2.2 我國部分種雞場(chǎng)REV抗體的ELISA檢測(cè)46
• 2.2.3 血清樣品的IFA鑒定46-48
• 2.2.3.1 雞胚成纖維細(xì)胞的制備46-47
• 2.2.3.2 REV感染陽性細(xì)胞的制備與鑒定47
• 2.2.3.3 待檢血清樣品的IFA鑒定47-48
• 2.2.4 某蛋雞群REV感染樣品采集與病毒的分離鑒定48-49
• 2.2.5 待檢血清學(xué)樣品的ELISA檢測(cè)49-50
• 2.2.6 分離毒株ENV基因的克隆與序列分析50-54
• 2.2.6.1 感染細(xì)胞DNA的提取50
• 2.2.6.2 引物的設(shè)計(jì)與合成50-51
• 2.2.6.3 ENV基因的PCR擴(kuò)增51
• 2.2.6.4 PCR產(chǎn)物的電泳鑒定51
• 2.2.6.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收與純化51-52
• 2.2.6.6 PCR產(chǎn)物與T載體的連接52
• 2.2.6.7 感受態(tài)細(xì)胞的制備52-53
• 2.2.6.8 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化53
• 2.2.6.9 重組菌的篩選和鑒定53
• 2.2.6.10 重組質(zhì)粒的酶切鑒定53-54
• 2.2.7 不同分離株的準(zhǔn)種比較及其分子演化54
• 2.2.8 REV的ENV片段與不同C3D組合原核表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)54-64
• 2.2.8.1 細(xì)胞的制備與病毒的增殖54-55
• 2.2.8.2 REV ENV基因的克隆55-57
• 2.2.8.3 雞C3D基因的克隆57-59
• 2.2.8.4 構(gòu)建不同重復(fù)C3D與ENV-1050融合PCR產(chǎn)物59-61
• 2.2.8.5 構(gòu)建含HIS標(biāo)簽的PET-ENV-1050, PET-ENV10502C3D, PET-ENV10503C3D和PET-ENV10504C3D重組表達(dá)載體61
• 2.2.8.6 誘導(dǎo)PET-ENV-1050, PET-ENV10502C3D, PET-ENV10503C3D和PET-ENV10504C3D表達(dá)61
• 2.2.8.7 蛋白質(zhì)電泳61-63
• 2.2.8.8 表達(dá)產(chǎn)物的WESTERN-BLOT檢測(cè)63
• 2.2.8.9 PET-ENV-1050, PET-ENV10502C3D和PET-ENV10503C3D的純化63-64
• 2.2.9 REV的ENV片段與不同C3D組合真核表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)64-68
• 2.2.9.1 將TPA標(biāo)簽克隆到PCDNA-FLAG載體中64-65
• 2.2.9.2 ENV與不同重復(fù)C3D串聯(lián)真核表達(dá)載體的構(gòu)建65-67
• 2.2.9.3 ENV與不同重復(fù)C3D串聯(lián)真核表達(dá)載體的表達(dá)67-68
• 2.2.9.4 重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)68
• 2.2.9.5 重組蛋白的WESTERN-BLOT鑒定68
• 2.2.10 重組蛋白的免疫效果初探68-69
• 3 試驗(yàn)結(jié)果69-90
• 3.1 我國部分種雞群REV感染的血清學(xué)調(diào)查69-77
• 3.1.1 曾祖代種雞場(chǎng)中REV抗體陽性率統(tǒng)計(jì)69
• 3.1.2 祖代種雞場(chǎng)中REV抗體陽性率統(tǒng)計(jì)69-70
• 3.1.3 父母代種雞場(chǎng)中REV抗體陽性率統(tǒng)計(jì)70-71
• 3.1.4 地方品系種雞中REV抗體陽性率統(tǒng)計(jì)71-73
• 3.1.5 ELISA和IFA鑒定結(jié)果的對(duì)比73
• 3.1.6 曾祖代中不同品系之間感染率比較分析73-74
• 3.1.7 曾祖代中不同品系之間感染率比較分析74-75
• 3.1.8 地方品系開產(chǎn)前后感染率比較分析75
• 3.1.9 ELISA 和 IFA 鑒定結(jié)果的對(duì)比75-77
• 3.2 某種雞群REV準(zhǔn)種多樣性分析77-79
• 3.2.1 病毒的分離鑒定77
• 3.2.2 不同分離株的準(zhǔn)種分析與比較77
• 3.2.3 不同分離株優(yōu)勢(shì)變種的分子演化77-79
• 3.3 不同C3D片段組合與ENV基因的串聯(lián)原核表達(dá)79-86
• 3.3.1 病毒的鑒定79
• 3.3.2 ENV基因的克隆79-80
• 3.3.3 雞C3D基因的克隆80-82
• 3.3.4 不同重復(fù)C3D序列構(gòu)建82-83
• 3.3.5 不同重復(fù)C3D序列與ENV-1050 PCR產(chǎn)物融合83
• 3.3.6 構(gòu)建PET-ENV-1050, PET-ENV10502C3D, PET-ENV10503C3D和PET-ENV10504C3D重組表達(dá)載體83-84
• 3.3.7 誘導(dǎo)PET-ENV-1050, PET-ENV10502C3D, PET-ENV10503C3D和PET-ENV10504C3D表達(dá)84-85
• 3.3.8 WESTERN-BLOT檢測(cè)85-86
• 3.3.9 PET-ENV-1050, PET-ENV10502C3D, PET-ENV10503C3D純化86
• 3.4 不同C3D片段組合與ENV基因的串聯(lián)真核表達(dá)86-88
• 3.4.1 將TPA標(biāo)簽克隆到PCDNA-FLAG載體中86
• 3.4.2 不同C3D片段組合與ENV基因的串聯(lián)真核表達(dá)載體構(gòu)建86-88
• 3.4.3 WESTERN-BLOT鑒定真核表達(dá)情況88
• 3.5 重組蛋白的免疫效果初探88-90
• 4 討論90-96
• 4.1 我國不同雞群中REV的流行狀況分析90-91
• 4.2 IFA和ELISA在REV血清學(xué)檢測(cè)中的比較91-92
• 4.3 同一雞群不同個(gè)體中REV準(zhǔn)種比較92-93
• 4.4 REV不同重復(fù)C3D與ENV-1050融合蛋白的表達(dá)與免疫效果初探93-96
• 5 本文結(jié)論96-97
• 參考文獻(xiàn)97-110
• 致謝110-111
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況111

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 孫淑紅;崔治中;曲立新;;母源抗體對(duì)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒感染誘發(fā)生長(zhǎng)遲緩和免疫抑制的預(yù)防作用[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年11期

  本文關(guān)鍵詞：我國部分種雞群REV感染血清學(xué)調(diào)查與亞單位疫苗探索，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：264628