本文關(guān)鍵詞：三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素Adh參與胸膜肺炎放線桿菌與宿主PAMs互作的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林大學(xué)》 2015年

三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素Adh參與胸膜肺炎放線桿菌與宿主PAMs互作的機(jī)制研究

王磊  

【摘要】：豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是一種組織嗜性很強(qiáng)的革蘭氏陰性菌，感染仔豬以纖維素性胸膜肺炎和出血性壞死性肺炎為特征，具有高度傳染性和致死性的呼吸系統(tǒng)疾病，黏附是APP定植和致病的關(guān)鍵因素。三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素(Trimeric Autotransporter Adhesin，TAA)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種能夠造成細(xì)菌感染致病的重要毒力因子。肺泡巨噬細(xì)胞（Primaryalveolar macrophages，PAMs）是肺部最早接觸病原微生物的免疫防御細(xì)胞之一，參與宿主天然性免疫和特異性免疫，細(xì)菌與PAMs的互作研究成為細(xì)菌致病機(jī)制的新熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)APP5b血清型L20強(qiáng)菌株上存在TAA，命名為Apa1，并證實(shí)其關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域?yàn)锳dh。本研究針對Adh開展以下工作： 1、利用Adh基因缺失菌株研究了Adh介導(dǎo)APP對仔豬PAMs的致病機(jī)制。本研究體外分離豬原代肺巨噬細(xì)胞并以5b野生菌（5b WT）和Adh基因缺失菌（5bΔAdh）加以感染，比較兩種細(xì)菌感染后細(xì)胞的差異，對感染早期10種炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子進(jìn)行細(xì)胞因子芯片和ELISA分析，發(fā)現(xiàn)5b WT感染過程中唯有趨化因子IL-8的分泌顯著高于5b ΔAdh（p0.05）。通過相應(yīng)信號通路抑制劑添加發(fā)現(xiàn)p38磷酸化被抑制后IL-8mRNA表達(dá)及因子分泌水平極顯著降低（p0.01），但對5bΔAdh感染的PAM細(xì)胞無影響，WesternBlot等方法證實(shí)Adh通過p38的磷酸化介導(dǎo)IL-8的高表達(dá)。體外中性粒細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)表明Adh的缺失對中性粒細(xì)胞體外趨化降低20%。另外發(fā)現(xiàn)三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素Adh可以介導(dǎo)APP引起的PAMs凋亡，Adh通過活化Fas和Bax等，激活下游caspase-8、9、3，從而促進(jìn)PAMs的凋亡。 2、利用APP特異性全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)系統(tǒng)分析了野生菌及Adh缺失菌在與宿主PAMs互作中的相應(yīng)性表達(dá)譜變化。本研究以目前報(bào)道的APP全基因組2886個(gè)基因?yàn)檠芯繉ο�，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在5b WT感染PAMs過程中有185個(gè)基因發(fā)生顯著性差異變化，包括92個(gè)上調(diào)基因和93個(gè)下調(diào)基因，上調(diào)基因主要參與能量代謝、基因轉(zhuǎn)錄與翻譯、毒力相關(guān)基因及三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素等；下調(diào)基因主要參與氨基酸代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)和輔酶代謝等。同時(shí)本研究首次報(bào)道了大量APP參與感染PAMs的新型毒力因子。通過將5b WT和5b ΔAdh表達(dá)譜進(jìn)行比較分析，獲得了受三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素功能區(qū)Adh調(diào)控的相關(guān)基因，共87個(gè)顯著性差異基因，其中包括46個(gè)上調(diào)基因和41個(gè)下調(diào)基因，上調(diào)基因主要集中到假定蛋白、脂代謝、能量代謝，基因的轉(zhuǎn)錄和加工等功能，下調(diào)基因則集中在假定蛋白、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、二級代謝合成等。 3、Adh在PAMs的互作蛋白的篩選與鑒定。目前，三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素與PAMs表面的互作蛋白尚未見報(bào)道，為此本研究以原核表達(dá)的Adh蛋白為誘餌，與RIPA裂解后的原代肺豬肺巨噬細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀，洗脫獲取的疑似蛋白經(jīng)蛋白質(zhì)質(zhì)譜及Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析，共獲取24種疑似互作蛋白。其中含量最高的蛋白為角蛋白，其次是血清白蛋白和熱休克蛋白70（HSP70）。具有膜表面分布的蛋白主要有嗅覺感受器受體、纖維母細(xì)胞生長因子受體等及胞內(nèi)NOD樣受體。將Uniprot預(yù)測的疑似蛋白基因插入到pDisplay載體中，構(gòu)建真核細(xì)胞膜表面表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過Adh粘附分析發(fā)現(xiàn)OR5M11基因表達(dá)產(chǎn)物粘附活性最高，且能促進(jìn)APP粘附293T細(xì)胞；利用OR5M11特異性抗體預(yù)處理細(xì)胞能夠顯著降低APP粘附PAMs及減少PAMs IL-8的釋放，并能顯著降低APP對PAMs的誘導(dǎo)凋亡作用。流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)除PAM細(xì)胞，人肺上皮細(xì)胞A549細(xì)胞系也存在OR5M11蛋白，提示Adh也具有介導(dǎo)APP對A549細(xì)胞的粘附作用。 4、以小鼠為動(dòng)物模型，研究了Adh的致病作用與機(jī)制。本研究以APP5bWT和5b ΔAdh共同滴鼻感染BALB/c小鼠，建立APP呼吸道感染小鼠模型，研究兩菌對小鼠的致病力差異。結(jié)果表明以2×108CFU，1×108CFU的APP感染小鼠，5b ΔAdh對小鼠致死率顯著降低于野生菌，表現(xiàn)為肺臟病理變化較輕、肺增重比下//肺灌洗液中總蛋白含量顯著降低（p＜0.05）、肺臟中前炎性細(xì)胞因子IL-1β和趨化因子CXCL1表達(dá)顯著下調(diào)。與5bΔAdh感染小鼠相比，5b WT感染后大量炎性細(xì)胞聚集于肺泡、肺間質(zhì)以及支氣管周圍。為證實(shí)Adh通過誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞過量募集導(dǎo)致的肺損傷，，利用G31P（趨化因子受體阻斷劑）處理小鼠可以顯著減弱5b WT感染所引起的肺臟中性粒細(xì)胞過量募集，且顯著緩解5b WT感染造成的肺部炎癥。肺臟免疫組化結(jié)果證實(shí)Adh參與APP感染小鼠MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活及促進(jìn)caspase-3表達(dá)，與細(xì)胞水平相一致。本研究首次證實(shí)三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素在APP感染小鼠過程中起重要作用，主要通過參與p38的磷酸化、早期炎性因子及中性粒細(xì)胞趨化因子的釋放等，誘發(fā)高水平免疫應(yīng)答增強(qiáng)APP對小鼠的致病性。 5、將致病菌APP回歸易感動(dòng)物仔豬，研究Adh參與的APP對仔豬致病性。本研究以5b WT和5bΔAdh菌株共同感染45日齡仔豬，觀察感染后仔豬臨床癥狀及病理變化，結(jié)果表明Adh參與APP對仔豬的早期致病性，主要變現(xiàn)為：5bΔAdh感染較5b WT肺炎臨床癥狀顯著滯后、肺臟細(xì)菌定植量減少、炎性因子特別是IL-8顯著降低等。仔豬血液常規(guī)的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)5b WT在感染后24h外周血出現(xiàn)典型的中性粒細(xì)胞高峰，而5bΔAdh感染仔豬未出現(xiàn)該現(xiàn)象。通過免疫組化進(jìn)一步證實(shí)Adh參與肺臟細(xì)胞分泌IL-8、MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化以及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。同時(shí)，為弄清5b WT和5bΔAdh感染仔豬肺臟內(nèi)在差異，采用豬特異性肺臟表達(dá)譜芯片技術(shù)對感染仔豬肺臟進(jìn)行差異基因檢測，與5b WT相比5bΔAdh感染仔豬肺臟共發(fā)現(xiàn)495個(gè)顯著性差異基因，包括274個(gè)上調(diào)基因，221個(gè)下調(diào)基因，上調(diào)基因主要集中在抗原加工與遞呈、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、DNA復(fù)制等，而下調(diào)通路主要集中在肌動(dòng)蛋白的內(nèi)化調(diào)節(jié)、細(xì)胞間粘附以及內(nèi)吞小體的形成途徑。芯片結(jié)果分析表明Adh可能通過下調(diào)宿主抗原加工與遞呈基因的表達(dá)增強(qiáng)對仔豬的致病性。該研究從易感動(dòng)物機(jī)體上證實(shí)三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素Adh參與的APP對仔豬致病性，為APP引起仔豬專嗜性肺炎的發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61
【目錄】：

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3 寇正罡;二苯基甲烷二異氰酸酯三聚體的制備[D];北京化工大學(xué);2010年

4 金超;高相容性甲苯二異氰酸酯三聚體的合成、性能及應(yīng)用[D];華南師范大學(xué);2005年

5 麥志遠(yuǎn);甲苯二異氰酸酯三聚體固化劑的制備與性能研究[D];華南理工大學(xué);2013年

6 張圓;異三聚體G蛋白在生長素介導(dǎo)的擬南芥根系發(fā)育中的作用機(jī)理研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2006年

7 王艷芳;水稻異三聚體G蛋白β亞基（RGB1）功能初步研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2013年

8 陳卓;六亞甲基二異氰酸酯固化劑的合成及結(jié)構(gòu)表征[D];華南理工大學(xué);2014年

9 周靚;胸膜肺炎放線桿菌三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1承載區(qū)的功能分析[D];吉林大學(xué);2011年

10 王娟娟;HDI三聚體-含異氰酸酯基硅氧烷復(fù)合物改性聚氨酯的研究[D];華中師范大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素Adh參與胸膜肺炎放線桿菌與宿主PAMs互作的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：212829