本文關(guān)鍵詞：宿主蛋白NPM1、EB3和HSP47對PEDV復(fù)制影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》 2015年

宿主蛋白NPM1、EB3和HSP47對PEDV復(fù)制影響

石達(dá)  

【摘要】：一般來說病毒感染后,宿主對病毒侵染最初的應(yīng)答是天然免疫應(yīng)答,如細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)和抗病毒免疫分子分泌等,通過這些免疫機(jī)制,宿主可以拮抗病毒的入侵,或者為宿主建立獲得性免疫應(yīng)答贏得時間從而最終清除入侵的病毒。但是,很多病毒在長期進(jìn)化的過程中獲得了避免細(xì)胞過早凋亡和抑制炎癥反應(yīng)的能力,從而得以在宿主體內(nèi)大量增殖,最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。冠狀病毒(Coronavirus, CoVs)這一大類病毒廣泛存在于自然界中,常見禽類、哺乳動物以及人類都易感。自2003年SARS-CoV(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus, SARS-CoV)的流行到2012年的MERS-CoV (Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, MERS-CoV)的出現(xiàn),引起了全世界人類的恐慌,2010-2013年豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea, PED)在世界大范圍肆虐更是重創(chuàng)了世界畜牧業(yè),至此,人們才對冠狀病毒感染后致病的嚴(yán)重程度以及快速的傳播能力給予了足夠的重視。PED是由套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒亞科(Coronavirinae) α、冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)的豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的,該病是豬的一種急性、高度接觸傳染性的腸道疾病,以嚴(yán)重的腸炎、嘔吐、水樣腹瀉和脫水為主要特征,各種日齡的豬均易感,尤其是哺育仔豬,發(fā)病率有時高達(dá)100%,死亡率為30-80%。因此,開展PEDV復(fù)制機(jī)制相關(guān)的基礎(chǔ)研究具有重要性,在解析冠狀病毒的復(fù)制機(jī)制方面更有普遍的借鑒意義。本研究在對PEDV N蛋白核定位特性研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步利用免疫共沉淀和GST-pull down試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)PEDV N蛋白和NPM1蛋白存在相互作用,并通過激光共聚焦試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),N蛋白和NPM1蛋白共定位于細(xì)胞的核仁中。隨后通過GST-pull down方法對兩者相互作用結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步鑒定,發(fā)現(xiàn)N蛋白aal47-294與NPM1蛋白的aa189-294是兩者相互作用的必需區(qū)域,并且NPM1蛋白的K263R突變可以促進(jìn)N和NPM1的相互作用。在探索NPM1蛋白在N蛋白核仁定位的作用中發(fā)現(xiàn)N蛋白的核仁定位并不依賴NPM1蛋白的核質(zhì)穿梭功能。在研究NPM1蛋白對病毒復(fù)制的作用中發(fā)現(xiàn),在PEDV感染的細(xì)胞中NPM1蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)。同時發(fā)現(xiàn)過表達(dá)NPM1蛋白時,可促進(jìn)N蛋白的表達(dá)和PEDV的增殖;相反,利用靶向NPM1蛋白的特異性干擾小RNA分子沉默PEDV易感細(xì)胞內(nèi)源性NPM1蛋白的表達(dá),N蛋白的表達(dá)和PEDV的增殖均受到抑制。進(jìn)一步對其分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)N蛋白和NPM1蛋白相互作用使其免于被切割,上調(diào)細(xì)胞的抗凋亡能力,避免細(xì)胞過早凋亡,進(jìn)而促進(jìn)病毒的復(fù)制。病毒從感染宿主細(xì)胞開始,宿主和病毒無時無刻不在相互作用。為了篩選與PEDV相互作用的宿主蛋白,本研究應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)和GST-pull down技術(shù)分別發(fā)現(xiàn)PEDV M蛋白和宿主蛋白EB3以及非結(jié)構(gòu)蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47之間存在相互作用。隨后我們進(jìn)一步用免疫共沉淀,激光共聚焦試驗(yàn)證明了PEDV M蛋白和宿主蛋白EB3以及非結(jié)構(gòu)蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47之間確實(shí)存在相互作用。有趣的是,在研究NSP7和HSP47蛋白共定位時發(fā)現(xiàn),單獨(dú)表達(dá)NSP7和HSP47蛋白時,發(fā)現(xiàn)NSP7蛋白定位在宿主細(xì)胞的細(xì)胞核中,HSP47蛋白分布在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,然而當(dāng)NSP7和HSP47蛋白共同表達(dá)時,兩者共定位在宿主細(xì)胞的細(xì)胞核周邊,說明兩者的相互作用改變了這兩種蛋白的亞細(xì)胞分布。本研究中另一項重要的內(nèi)容是PEDV M蛋白和宿主蛋白EB3以及非結(jié)構(gòu)蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47相互作用是否影響PEDV的復(fù)制,以及影響PEDV復(fù)制的分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)PEDV M蛋白和宿主蛋白EB3以及非結(jié)構(gòu)蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47相互作用對PEDV復(fù)制的影響正好是對立的,在PEDV感染的細(xì)胞中,EB3蛋白表達(dá)顯著增加,并且我們通過轉(zhuǎn)染表達(dá)有EB3蛋白真核表達(dá)重組質(zhì)粒來上調(diào)Vero E6中內(nèi)源性的EB3蛋白,通過檢測M蛋白的表達(dá)情況和TCIDso測定,結(jié)果顯示可以促進(jìn)M蛋白的表達(dá)并且顯著增強(qiáng)PEDV的增殖。而病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47相互作用對病毒復(fù)制的影響正好相反,研究發(fā)現(xiàn)在PEDV感染48h和60h,HSP47蛋白表達(dá)顯著降低,進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染表達(dá)有HSP47蛋白真核表達(dá)重組質(zhì)粒來上調(diào)Vero E6中內(nèi)源性的HSP47蛋白,發(fā)現(xiàn)顯著抑制病毒N蛋白表達(dá)以及PEDV的增殖。M和EB3以及NSP7和HSP47相互作用影響PEDV復(fù)制的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

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