本文關(guān)鍵詞：甜菜黑色焦枯病毒侵染本生煙后復(fù)制場所的形態(tài)發(fā)生及誘導(dǎo)寄主反應(yīng)的機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2015年

甜菜黑色焦枯病毒侵染本生煙后復(fù)制場所的形態(tài)發(fā)生及誘導(dǎo)寄主反應(yīng)的機(jī)制

曹修嶺  

【摘要】：植物病毒中很大一類屬于正義RNA病毒,正義RNA病毒在侵染過程中都會在寄主細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)上形成各種的復(fù)制場所以完成病毒RNA的復(fù)制。雖然關(guān)于正義RNA病毒復(fù)制場所的研究已經(jīng)開展了較多的工作,但是對復(fù)制場所的形成機(jī)制仍有待深入研究。本研究以單鏈正義的甜菜黑色焦枯病毒(Beet black scorch virus, BBSV)為研究材料,對其侵染本生煙后復(fù)制場所的定位、形態(tài)發(fā)生以及三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,并對參與BBSV復(fù)制的未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response, UPR)和相關(guān)的寄主因子進(jìn)行了探究。 首先,通過激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察到BBSV侵染的本生煙中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)形成了聚集體,同時透射電子顯微鏡(TEM)觀察發(fā)現(xiàn)感染BBSV的細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生了重塑,形成了交疊卷曲狀結(jié)構(gòu),并且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜凹陷形成了很多小泡結(jié)構(gòu)(spherules)。利用雙分子熒光互補(bǔ)實驗(BiFC)也證實BBSV p23-p82復(fù)合體可以特異的與ER聚集體共定位。此外,利用免疫膠體金分別檢測BBSV的復(fù)制輔助蛋白p23以及dsRNA中間體,結(jié)果表明p23可特異的定位在ER膜上以及小泡結(jié)構(gòu)上,而dsRNA可以在小泡結(jié)構(gòu)上被特異的檢測到。以上結(jié)果說明,BBSV侵染本生煙后形成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡結(jié)構(gòu)是BBSV的復(fù)制場所。 將p23蛋白在本生煙葉片中瞬時表達(dá),CLSM觀察結(jié)果顯示表達(dá)p23的細(xì)胞中伴隨有ER聚集體的形成,且與p23蛋白共定位。進(jìn)一步TEM觀察結(jié)果表明p23的表達(dá)能夠引起ER發(fā)生卷繞和聚集。與此相反,在本生煙中表達(dá)BBSV編碼的其他蛋白并沒有看到ER發(fā)生上述類似的形態(tài)變化。說明p23蛋白是BBSV侵染過程中誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重塑的關(guān)鍵蛋白,但單獨表達(dá)p23并不能誘導(dǎo)形成類似病毒侵染的復(fù)制小泡結(jié)構(gòu)。通過膜浮選實驗(membrane flotation assay)和構(gòu)建p23缺失突變體證明p23蛋白是膜錨定蛋白,其N端的跨膜區(qū)不僅對于p23的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位有決定性作用,而且對于其重塑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的能力也是必需的。 本文還利用電子斷層成像和三維重構(gòu)技術(shù)對BBSV的復(fù)制場所進(jìn)行了三維重構(gòu)和渲染,這在植物病毒中尚屬首次報道,與已報道的動物病毒在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成復(fù)制場所的三維結(jié)構(gòu)相比,有其自身的特點。通過三維重構(gòu)結(jié)果發(fā)現(xiàn),病毒的復(fù)制小泡和胞質(zhì)能夠通過一個直徑約5-7nm的小管相連通。另外,病毒誘導(dǎo)形成的泡包(vesicle packets)之間也是可以連通的。此外,我們也對復(fù)制泡中的絲狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了三維渲染,結(jié)果顯示其形態(tài)呈現(xiàn)多樣性。BBSV復(fù)制場所的三維結(jié)構(gòu)不僅為研究BBSV的復(fù)制提供了新的視野,也為研究其他病毒的復(fù)制場所提供了有價值的參考。 本研究中,無論是通過PVX病毒載體還是35S啟動子表達(dá)p23蛋白都能夠引起本生煙注射葉片發(fā)生壞死,而這種細(xì)胞壞死作用可以通過過表達(dá)BiP蛋白來抑制,說明p23過表達(dá)引起的細(xì)胞壞死與寄主的未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)存在相關(guān)性。Northern blot分別檢測BBSV侵染本生煙后不同時間點6個不同UPR相關(guān)基因(bZIP60, BiP, PDI, CRT, CAM和SKP1)的表達(dá)水平,結(jié)果表明不同UPR基因的表達(dá)調(diào)控呈現(xiàn)時間依賴性。利用TRV-VIGS沉默UPR通路的關(guān)鍵基因bZIP60后,BBSV在本生煙中的積累量發(fā)生明顯下降,且BBSV侵染細(xì)胞中形成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集體數(shù)量明顯減少,說明UPR在BBSV侵染過程中發(fā)揮重要作用,對維持病毒正常侵染是必須的。這也是植物病毒中首次報道病毒復(fù)制輔助蛋白可以誘發(fā)UPR。 最后,對BBSV復(fù)制過程中所需的寄主因子進(jìn)行了研究,初步結(jié)果表明BBSV的侵染可以誘導(dǎo)熱激蛋白Hsp70和Hsp90表達(dá)量的升高,而下調(diào)Hsp70和Hsp90的表達(dá)后能夠嚴(yán)重影響B(tài)BSV在本生煙中的復(fù)制。后續(xù)利用BiFC和GST pull-down實驗證明p23蛋白能夠分別與Hsp70和Hsp90直接互作,說明Hsp70和Hsp90直接參與了BBSV病毒RNA的復(fù)制。關(guān)于Hsp70和Hsp90如何參與BBSV的復(fù)制還有待于后續(xù)的深入研究。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S432.41
【目錄】：

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本文編號：184111