本文選題：銨態(tài)氮　切入點：硝態(tài)氮　出處：《華南農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：硝態(tài)氮(NO3-)和銨態(tài)氮(NH4+)是植物吸收的兩種主要氮源,二者對植物細胞氧化還原狀態(tài)、光合作用、水分吸收、礦質(zhì)養(yǎng)分吸收及代謝等生理生化過程都有著不同的效應。研究表明,對于許多蔬菜作物而言,適當比例的銨硝態(tài)氮混合營養(yǎng)比單一氮源更能促進植物的生長和對氮素的吸收,并能提高氮素利用效率。但目前對于NH4+在氮素吸收過程中是否存在調(diào)控作用及其分子機制還不十分清楚。菜心(Brassica campestris L.ssp.chinensis var.Utilis Tsen et Lee),又名菜薹,為十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種中的一個變種,以幼嫩薹莖和葉片兩部分為主要食用器官,是華南地區(qū)栽培面積和產(chǎn)量都最大的特產(chǎn)蔬菜,現(xiàn)在全國各地均有栽培。菜心喜硝,在水培條件下以吸收硝態(tài)氮為主,極易積累硝酸鹽。本論文從NH4+對菜心氮素吸收的調(diào)控作用,菜心銨離子轉運蛋白家族基因AMT1對不同氮素供應的響應特性以及不同銨硝比下菜心根系表達譜分析等幾個方面在分子水平上探究銨態(tài)氮對菜心根系吸收氮素的分子調(diào)控機制,主要結果如下:1.NH4+對菜心生長和根系吸收氮素的調(diào)控作用在等氮水平下設不同銨硝配比處理(0:100,5:95,25:75,50:50)以及等硝水平下增施不同濃度NH4+(0 m M、0.5 m M、1 m M和2 m M)處理,結果表明,與全硝營養(yǎng)相比,菜心在銨硝比為5:95和25:75以及增施0.5 m M和1 m M NH4+處理中的生物量均顯著提高,但NH4+占總氮比例達50%時,菜心根系和地上部的生長均受到顯著抑制。在4 m M NO3-營養(yǎng)的基礎上施加微量NH4+(0.1m M)也能顯著提高菜心地上部的生物量,同時還顯著促進了根系對氮素的吸收,提高了植株的總氮積累量。2.菜心銨離子轉運蛋白基因Bc AMT的克隆及其基本表達特性分析克隆得到了菜心Bc AMT1;1、Bc AMT1;3、Bc AMT1;4和Bc AMT1;5基因的c DNA全長序列,經(jīng)過序列分析和蛋白結構域預測推測它們均是跨膜蛋白,與細菌銨離子轉運蛋白Amt B有相似的結構區(qū)域。洋蔥表皮亞細胞定位實驗表明,四個基因均定位于細胞膜上,而酵母功能互補實驗表明4個菜心Bc AMT蛋白均具能使缺陷型酵母31019b在NH4+單一氮源培養(yǎng)基上恢復生長,這表明4個Bc AMT1s蛋白均有NH4+轉運活性。Bc AMT1;1、Bc AMT1;3和Bc AMT1;5均在根系中表達量最高,而Bc AMT1;4則在根系中不表達,只在葉片和花朵中有表達。Bc AMT1;1、Bc AMT1;3和Bc AMT1;5在根系中的表達均存在晝夜節(jié)律,Bc AMT1;1的表達受光抑制,而Bc AMT1;3和Bc AMT1;5則在高光強下表達上調(diào)。3.根系Bc AMT1s基因?qū)Σ煌吹捻憫匦岳胵 RT-PCR技術對相關基因的表達進行相對定量分析,利用15N同位素示蹤法分析根系對NH4+的吸收速率。結果表明,缺氮處理均促進了Bc AMT1;1、Bc AMT1;3和Bc AMT1;5在根系的表達,同時提高了根系對NH4+的吸收能力。恢復供應NO3-后Bc AMT1;1和Bc AMT1;5的表達均顯著下調(diào),而Bc AMT1;3的表達變化不大。結合外源供應單一NH4+對菜心根系Bc AMT1s基因的濃度響應曲線(圖3.3)和時間響應曲線(圖3.4)來看,總體來講,Bc AMT1;1和Bc AMT1;5的表達在短時間內(nèi)受NH4+的誘導,長時間高濃度NH4+處理后則表達下調(diào),而Bc AMT1;3則對外源NH4+很敏感,無論菜心植株處于何種氮營養(yǎng)水平下,低濃度或高濃度NH4+處理均短時間內(nèi)就顯著抑制其表達。此外,不同濃度NH4+處理2 h均使菜心根系對NH4+的吸收能力顯著降低。與全硝營養(yǎng)相比,短時間(48 h)內(nèi)混合銨硝態(tài)氮處理均顯著抑制了菜心Bc AMT1s基因的表達,而不同銨硝比氮源長期(10 d以上)處理實驗中,與全硝營養(yǎng)相比,根系Bc AMT1;1、Bc AMT1;3和Bc AMT1;5均是在低NH4+處理下表達水平最高,當NH4+濃度達1 m M以上時表達均受到抑制。4.菜心根系吸收法瞬時表達系統(tǒng)的建立半定量PCR和實時熒光定量PCR的結果均表明本研究成功建立了農(nóng)桿菌介導的菜心根系吸收法瞬時表達系統(tǒng),并對轉化條件進行了優(yōu)化,結果表明,不經(jīng)過高滲處理的菜心植株以OD600=0.3的菌液靜置浸染3-9 h可取得較高的轉化效率,目的基因在根系的超表達可持續(xù)2-4 d,在轉化后第6 d,目的基因表達水平開始下降。5.Bc AMT1;3對Bc AMT和Bc NRT基因表達及根系吸收氮素能力的調(diào)控瞬時超表達菜心根系Bc AMT1;3顯著促進了Bc AMT1;1和Bc AMT1;5以及Bc NRT1;1和Bc NRT2;1在根系的表達均顯著上調(diào),同時顯著提高了菜心根系對NH4+和NO3-的吸收;反之,抑制菜心根系Bc AMT1;3的表達使Bc AMT1;1、Bc NRT1;1和Bc NRT2;1的表達均顯著降低,但菜心根系對NH4+和NO3-的吸收無顯著差異。6.不同銨硝配比下,菜心根系轉錄組分析利用RNA-Seq技術首次獲得了菜心的轉錄組信息,包含53746條unigene序列,其中78.61%的序列在公共數(shù)據(jù)庫得到了注釋。同時,對不同銨硝配比(CK:0/100,T1:5/95,T2:25/75,T3:50/50)處理15 d后的菜心根系作了表達譜分析,結果共2242個unigene差異表達,共覆蓋了97個KEGG代謝通路,其中有13個顯著富集通路,主要包括光合相關代謝途徑,植物激素信號傳導途徑和氮素代謝途徑,等。此外,在菜心根系轉錄中還鑒定了2913個轉錄因子,其中189個在4個氮素處理間表現(xiàn)出了表達差異。綜上所述,NH4+不僅是作為營養(yǎng)物質(zhì)還很可能作為信號分子調(diào)控菜心生長和氮素吸收,且Bc AMT1;3很可能參與了菜心NH4+調(diào)控途徑,正向調(diào)控Bc AMT1;1和Bc AMT1;5以及Bc NRT1;1和Bc NRT2;1在根系的表達以及菜心根系對NH4+和NO3-的吸收,而激素信號途徑相關基因及轉錄因子也廣泛參與了根系氮素吸收及代謝調(diào)控。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S634.5

【參考文獻】

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本文編號：1607618