發(fā)布時間：2018-03-04 22:08

  本文選題：煙草　切入點：NtTTG2　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：植物TTG (TRANSPARENT TESTA GLABRA)蛋白的功能被假定為參與生長素信號通路然后調(diào)節(jié)一系列的生長發(fā)育過程。植物的生長發(fā)育主要受生長素信號通路的控制,生長素應(yīng)答因子(auxin response factor,ARF)參與生長素信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本博士論文主要研究了 WD40結(jié)構(gòu)域蛋白NtTTG2和轉(zhuǎn)錄因子NtARF8對植物生長發(fā)育的調(diào)控作用。生長素可以通過抑制水楊酸信號傳導(dǎo)來抑制抗病防衛(wèi)反應(yīng)。本論文從表型上研究了轉(zhuǎn)錄因子NtARF8對煙草抗病性的影響。這些研究有助于進一步理解植物生長發(fā)育機制,同時為闡明植物生長發(fā)育信號通路和抗病防衛(wèi)反應(yīng)信號通路的交叉調(diào)控提供了理論基礎(chǔ)。1.NtARF8 NtARF17,NtARF19參與NtTTG2調(diào)控的植物生長功能通路TTG蛋白早期被鑒定為植物表皮和種子發(fā)育的核心調(diào)節(jié)子,在功能調(diào)控這一方面一直受到長期的關(guān)注。為了驗證NtTTG2與植物生長素之間的關(guān)系,我們用生長素合成劑NAA處理了煙草葉片,實驗表明用NAA處理后NtTTG2的表達量有明顯的增加,這個結(jié)果說明NtTTG2能夠感應(yīng)生長素。同時,我們檢測了野生型植株、TTG2沉默植株、TTG2過表達植株中葉片、花、果實中的生長素IAA含量,發(fā)現(xiàn)這三種植株的相同器官上的生長素含量沒有明顯的變化,說明NtTTG2不影響內(nèi)源生長素的含量�；谙惹皩嶒炇覍tTTG2的轉(zhuǎn)錄組實驗研究數(shù)據(jù),通過生物信息學(xué)分析比對,我們發(fā)現(xiàn)了包括NtARF8、NtARF17和NtARF19在內(nèi)的12個受NtTTG2調(diào)控表達的生長素受體因子(ARF)。通過病毒介導(dǎo)的沉默方法(Virus-Induced Gene Silencing , VIGS)將這12個ARFs在野生型植株、TTG2沉默植株、TTG2過表達植株中分別進行了瞬時沉默。熒光定量PCR實驗分析表明成功沉默了這些ARF基因,同時發(fā)現(xiàn)NtTTG2能夠增加NtARF8、NtARF17和NtARF1夕的表達量。通過生長表型的觀察和植物重量變化的測定發(fā)現(xiàn):當(dāng)NtARF8、NtARF17和NtARF19沉默時,與對照組相比,植株的生長和重量受到抑制,結(jié)果表明NtTTG2能夠通過調(diào)控NtARF8、NtARF17和NtARF19從而正調(diào)控植物的生長發(fā)育。2. NtARF8作為轉(zhuǎn)錄激活子促進植物生長發(fā)育為了進一步研究并驗證NtARF8、NtARFJ7、NtARF19在NtTTG2調(diào)控生長發(fā)育信號通路中的作用,我們對這三個基因進行了兩兩之間的沉默和三個基因的同時沉默。熒光定量PCR實驗分析發(fā)現(xiàn)這三個基因的沉默都是獨立的,其中一個基因的沉默不會影響另外兩個基因的表達。通過分析不同基因型植株的重量變化倍數(shù),發(fā)現(xiàn)NtARF8基因沉默相較于NtARF17和NtAF19的沉默對煙草的生長有更明顯的抑制作用。通過測定野生型植株、TTG2沉默植株、TTG2過表達植株中根、莖、葉、花、果實中NtARF8的表達量,分析發(fā)現(xiàn)在不同器官中NtARF8的表達量受到NtTTG2的正向調(diào)控,結(jié)果表明NtARF8還參與由NtTTG2介導(dǎo)的其它生長發(fā)育過程。我們分別觀察了野生型植株、TTG2沉默和過表達植株、ARF8沉默和過表達植株以及TTG2、ARF8同時沉默和過表達植株的生長情況以及果實種子的發(fā)育情況,并對植株高、重量、種子的產(chǎn)量進行數(shù)量統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)NtTTG2、NtARF8能夠促進植物的生長發(fā)育和煙草種子的產(chǎn)量。通過對NtARF8蛋白質(zhì)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)其中間區(qū)域包含了富含谷氨酰胺的保守序列,我們預(yù)測它可能是一個轉(zhuǎn)錄激活子。為了驗證這一假設(shè),實驗中我們引入GH3基因,GH3基因是一個被證實的生長素早期應(yīng)答因子,它的啟動子上有兩段典型的生長素應(yīng)答元件TGTCT的重復(fù)序列。通過凝膠電泳遷移率分析(GMSA)和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗發(fā)現(xiàn)NtARF8能夠與GH3基因的啟動子特異性的結(jié)合,結(jié)果表明NtARF8作為轉(zhuǎn)錄激活子行使其功能。3. NtTTG2通過促進NtARF8的細胞核定位從而增強它作為轉(zhuǎn)錄激活子的作用通過酵母雙雜交和熒光雙分子互補實驗發(fā)現(xiàn)NtTTG和NtARF8不能夠直接互作。以TTG2沉默的TTG2i植株、帶有RFP標簽的WT植株、融合RFP的TTG2過表達的TTG2+:RFP植株為材料,對融合黃色熒光蛋白YFP的ARF8進行瞬時表達,然后采用激光共聚焦顯微鏡對YFP的瞬時表達情況進行仔細觀察。結(jié)果表明ARF8的細胞定位受到TTG2的影響。ARF8在TTG2+:RFP植株中主要定位于細胞核,但在TTG2i植株中只有較弱的熒光,說明TTG2促進ARF8定位到細胞核。將ARF8在WT:RFP、TTG2+:RFP、TTG2i植株中瞬時表達后,通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)在TTG2過表達植株中ARF8蛋白在細胞核中的表達量增加了,而在TTG2沉默植株中ARF8的蛋白量不管在細胞質(zhì)和細胞核中都明顯的降低了,說明TTG2的沉默或過表達影響了 ARF8蛋白在細胞質(zhì)和細胞核的表達量分布。結(jié)合ChIP和qRT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)在TTG2過表達的植株中,ARF8和GH3啟動子的結(jié)合能力明顯的提高了,而且在過表達植株中GH3基因的表達含量明顯上升。這些結(jié)果表明NtTTG2通過促進NtARF8的細胞核定位從而增強它作為轉(zhuǎn)錄激活子的作用。4. NtTTG2和NtARF8對植物抗病性的影響前面的內(nèi)容我們主要討論了 NtTTG2和NtARF因子對煙草生長發(fā)育的影響。本章我們主要從表型方面觀察研究了 NtTTG2和NtARF8對植物抗病性的影響。本實驗室已經(jīng)研究表明,TTG2能夠負調(diào)控植物的抗病性,而這主要是由于其能夠?qū)χ参锏姆佬l(wèi)反應(yīng)(主要由SA/NPR1信號通路介導(dǎo))產(chǎn)生抑制作用。我們在不同TTG2基因型煙草上利用病毒沉默技術(shù)沉默了NtARF 基因,然后對煙草葉片分別接種煙草花葉病毒(TMV)和大白菜軟腐病菌(Pcc),并用緩沖液作為對照,隨后觀察發(fā)病表型并檢測了發(fā)病程度。結(jié)果表明,與野生型植株相比,TTG2沉默后植物的抗病性升高了,而當(dāng)TTG2過表達后植物感病嚴重,這與實驗室之前的研究結(jié)果一致;而ARF8基因沉默后也會提高植物的抗病性;當(dāng)這兩個基因同時沉默時,植物的抗病性比它們各自單獨沉默時都提高了。實驗結(jié)果表明NtTTG2和NtARF8對植物的抗病性有負調(diào)控作用。5.酵母雙雜篩選AtTTG1蛋白的互作因子TTG蛋白是一個典型的WD40結(jié)構(gòu)域蛋白,WD40蛋白的主要功能是與其他蛋白質(zhì)互作,形成復(fù)合體結(jié)構(gòu),從而調(diào)控下游的反應(yīng)。先前的實驗表明,NtARF8和NtTTG2兩者之間不存在直接互作,根據(jù)實驗結(jié)果推測,NtTTG2在調(diào)節(jié)NtARF8的過程中還存在其它作用因子。實驗室先前對氨基酸序列進行同源性對比表明,NtTTG2與AtTTG1、NtTTG1的同源性很高(77.7%)。于是我們在擬南芥文庫中利用酵母雙雜交技術(shù)去篩選能夠與AtTTG1蛋白互作的相關(guān)因子。如果能篩選得到相應(yīng)的蛋白在反推去研究與NtTTG2互作的相關(guān)蛋白。本實驗以AtTTG1為誘餌,對擬南芥cDNA文庫進行篩選,并利用營養(yǎng)缺陷型和β -半乳糖苷酶活性初步篩選到35個陽性克隆,測序并在GenBank中進行序列比對并進行功能分析,為研究TTG蛋白的相關(guān)互作機制提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S572;S435.72

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本文編號：1567505