本文選題：牛　切入點：體細胞核移植　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：利用體細胞核移植技術(shù)(SCNT)來生產(chǎn)克隆動物和轉(zhuǎn)基因動物被認為是最為有效的方法,特別是在動物遺傳育種,動物品種保護,生物醫(yī)藥等諸多方面該方法具有巨大的應(yīng)用前景。但是目前SCNT動物的生產(chǎn)效率還較低,通常認為主要原因是由于在體細胞核移植過程中體細胞的核不完全重編程所導(dǎo)致的,因此研究如何提高SCNT胚胎的重編程效率,特別是提高植入前胚胎的發(fā)育率和胚胎質(zhì)量,進而提高SCNT動物的生產(chǎn)效率,對于SCNT技術(shù)的廣泛推廣應(yīng)用具有十分重要的意義。本試驗通過對比體外培養(yǎng)條件下的牛SCNT胚胎與體外受精(IVF)胚胎在植入前的早期發(fā)育過程中發(fā)育率的差異,檢測在發(fā)育率具有顯著差異的時期兩類胚胎中與重編程密切相關(guān)基因的表達差異,并通過microRNAs的RNA干擾技術(shù)來提高牛SCNT胚胎植入前胚胎發(fā)育率和胚胎質(zhì)量,主要研究結(jié)果如下:1.對比牛SCNT胚胎與IVF胚胎在體外培養(yǎng)環(huán)境下在植入前五個發(fā)育節(jié)點胚胎發(fā)育率的異常,發(fā)現(xiàn)在2-cell和4-cell時期兩類胚胎的發(fā)育率沒有顯著差異,而SCNT胚胎在8-cell、桑葚胚和囊胚時期的發(fā)育率要顯著低于IVF胚胎的發(fā)育率。進一步檢測在8-cell、桑葚胚和囊胚這三個時期牛SCNT胚胎與IVF胚胎中與重編程密切相關(guān)的基因OCT4、SOX2、KLF4,以及IGFBP3和IGF2的表達量的差異,發(fā)現(xiàn)牛SCNT胚胎中OCT4、SOX2、KLF4這三個基因的表達量要顯著低于IVF胚胎中的表達量,提示這與牛SCNT胚胎發(fā)育率的異常有關(guān);同樣發(fā)現(xiàn)相對于牛IVF胚胎,SCNT胚胎中IGFBP3的表達量顯著減少,而IGF2的表達量顯著增加,提示這與牛胚胎發(fā)育率異常相關(guān),并且與克隆動物過度生長有關(guān)。2.由于microRNAs能夠特異性的抑制其靶基因的表達,再利用microRNAs inhibitor能夠特異性的抑制具體microRNA作用的這一特點,通過抑制microRNA-145的表達來促進其靶基因OCT4、SOX2、KLF4的表達,發(fā)現(xiàn)在用40μM的microRNA-145 inhibitor處理牛SCNT胚胎后,胚胎在8-cell、桑葚胚和囊胚這三個時期的發(fā)育率有了顯著提高。進一步檢測后發(fā)現(xiàn)胚胎中OCT4、SOX2、KLF4的表達量有了顯著的升高,說明microRNA-145 inhibitor能夠提高胚胎中OCT4、SOX2、KLF4基因的表達,提高克隆胚的重編程效率。3.IGFBP3能夠與IGF2特異性結(jié)合從而抑制IGF2發(fā)揮生物學(xué)作用,同時IGFBP3也是microRNA-483的靶基因,在試驗中我們發(fā)現(xiàn)在用100μM的microRNA-483 inhibitor處理牛SCNT胚胎后,胚胎在8-cell、桑葚胚和囊胚這三個時期的發(fā)育率有了顯著提高。進一步檢測后發(fā)現(xiàn)胚胎中IGFBP3的表達量有了顯著升高,并且IGF2的表達量有了顯著降低,說明microRNA-483 inhibitor能夠提高胚胎中IGFBP3的表達量,增加的IGFBP3能夠結(jié)合更多的IGF2,從而降低IGF2的表達量,糾正因重編程異常所引起的胚胎發(fā)育異常。
[Abstract]:The use of somatic cell nuclear transfer (SCNT) technology to produce cloned and transgenic animals is considered to be the most effective method, especially in animal genetics and breeding, animal variety protection, This method has great application prospect in many aspects, such as biomedicine. But at present, the production efficiency of SCNT animals is still low. It is generally believed that the main reason is the incomplete nuclear reprogramming of somatic cells during somatic cell nuclear transfer. Therefore, how to improve the efficiency of reprogramming of SCNT embryos, especially the development rate and embryo quality of preimplantation embryos, so as to improve the productivity of SCNT animals is studied. It is of great significance for the wide application of SCNT technology. In this study, we compared the developmental rates of bovine SCNT embryos in vitro with those of IVF embryos in vitro during their early development before implantation. The expression of genes closely related to reprogramming was detected in two types of embryos with significant differences in development rate, and the RNA interference technique of microRNAs was used to improve the development rate and embryo quality of bovine SCNT embryos before implantation. The main results were as follows: 1. There was no significant difference in the development rates of bovine SCNT embryos and IVF embryos in the first five developmental nodes during 2-cell and 4-cell periods, compared with those of IVF embryos in vitro. The development rate of SCNT embryos at 8-cell, morula and blastocyst stages was significantly lower than that of IVF embryos. Further, the gene OCT4SOX2 and KLF4, which was closely related to reprogramming in bovine SCNT embryos and IVF embryos in 8-cell, morula and blastocyst stages, was further detected. And the differences in the expression levels of IGFBP3 and IGF2, It was found that the expression of OCT4, SOX2, KLF4 in bovine SCNT embryos was significantly lower than that in IVF embryos, which suggested that the expression of OCT4SOX2KLF4 gene was related to the abnormal development rate of bovine SCNT embryos, and it was also found that the expression of IGFBP3 in bovine IVF embryos was significantly lower than that in bovine IVF embryos. However, the expression of IGF2 was significantly increased, which suggested that it was related to the abnormal rate of bovine embryo development and to the over-growth of cloned animals. Because microRNAs could specifically inhibit the expression of its target gene, Using the characteristic that microRNAs inhibitor can specifically inhibit the effect of specific microRNA, and by inhibiting the expression of microRNA-145, we can promote the expression of its target gene OCT4, SOX2, KLF4. It was found that after the treatment of bovine SCNT embryos with 40 渭 M microRNA-145 inhibitor, The development rate of embryos in 8-cell, morula and blastocyst was significantly increased. Further detection showed that the expression of OCT4OX2SOX2KLF4 was significantly increased in embryos, which indicated that microRNA-145 inhibitor could increase the expression of OCT4SOX2KLF4 gene in embryos. 3. IGFBP3 can specifically bind with IGF2 to inhibit the biological effect of IGF2, and IGFBP3 is also a target gene of microRNA-483. In the experiment, we found that after 100 渭 M microRNA-483 inhibitor was used to treat bovine SCNT embryos, The developmental rate of embryos in 8-cell, morula and blastocyst increased significantly. The expression of IGFBP3 and IGF2 in embryos were significantly increased, and the expression of IGF2 was significantly decreased, after further detection, there was a significant increase in the expression of IGFBP3 in embryos, and a significant decrease in the expression of IGF2 in embryos. The results showed that microRNA-483 inhibitor could increase the expression of IGFBP3 in embryos, and the increased IGFBP3 could combine with more IGF2, thus reducing the expression of IGF2 and correcting the abnormal development of embryos caused by abnormal reprogramming.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S814.8

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