本文關(guān)鍵詞： 疫霉菌 cyclophilin 無毒基因 效應(yīng)分子 Nudix水解酶 植物免疫　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆疫霉根腐病是大豆生產(chǎn)上的毀滅性病害,每年在全世界范圍內(nèi)造成10-20億美元的損失。大豆疫霉分泌大量效應(yīng)分子進(jìn)入植物細(xì)胞干擾植物免疫反應(yīng)并促進(jìn)侵染。這些效應(yīng)分子中有一類蛋白在分泌信號肽后含有保守的Arg-X-Lys-Arg (RXLR)序列特征,被稱為RXLR效應(yīng)蛋白。大豆疫霉菌基因組中存在著300多個編碼該類效應(yīng)蛋白的基因,其中9個RXLR基因,如Avr1b、Avr3a、Avr4/6已被證明是大豆疫霉菌的無毒基因,這些基因的編碼產(chǎn)物能被大豆進(jìn)化出的抗病蛋白特異性地識別從而誘導(dǎo)大豆的抗病反應(yīng)。然而,這些RXLR基因的生物學(xué)功能及其作用機(jī)理尚不清楚。針對該科學(xué)問題,本論文以實驗室先前克隆到的無毒基因Avr3b為研究對象,開展了一系列遺傳和生化實驗,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)Avr3b能夠通過其具有的NADH和ADP-ribose焦磷酸化酶的活性抑制植物的免疫反應(yīng),另外Avr3b還需要招募植物的cyclophilin蛋白激活它的毒性和無毒功能,初步揭示了 Avr3b的生物學(xué)功能和作用機(jī)理。大豆疫霉無毒效應(yīng)分子Avr3b是調(diào)節(jié)植物免疫反應(yīng)的NADH和ADP-ribose焦磷酸化酶。本研究發(fā)現(xiàn)在煙草中瞬時表達(dá)Avr3b基因能夠增強(qiáng)煙草對辣椒疫霉和寄生疫霉的感病性,并且顯著減少活性氧在侵染點(diǎn)的積累。Avr3b編碼蛋白被預(yù)測含有具有轉(zhuǎn)運(yùn)到寄主胞內(nèi)功能的RXLR motif、具有形成穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的Wmotif和C端的水解酶功能域Nudix motif。通過生化實驗本研究證實Avr3b具有NADH和ADP-ribose焦磷酸化酶活性,缺失Avr3b的Nudix motif或者突變該motif中決定水解酶活的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)會導(dǎo)致Avr3b的酶活喪失,進(jìn)而導(dǎo)致毒性功能減弱。另外,Avr3b也能夠抑制大豆疫霉效應(yīng)分子Avrlb引起的ETI反應(yīng)。由于具有類似酶活的植物Nudix水解酶是植物免疫系統(tǒng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子,因此,本研究結(jié)果提示病原菌可能痛通過分泌具有Nudix水解酶活性的效應(yīng)分子Avr3b進(jìn)入寄主細(xì)胞干擾植物免疫。Avr3b需要植物cyclophilin蛋白激活自身的Nudix水解酶活性。先前研究證明了大豆疫霉RXLR效應(yīng)分子Avr3b在植物細(xì)胞中表達(dá)具有Nudix水解酶功能。但是,原核表達(dá)的Avr3b沒有Nudix水解酶活性,將原核表達(dá)的Avr3b蛋白和植物蛋白提取物進(jìn)行孵育則又恢復(fù)了 Nudix水解酶活性。針對這一現(xiàn)象,本研究通過進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)Avr3b 在植物中需要肽脯氨酰順反異構(gòu)酶(prolyl-peptidyl isomerase, PPIase)cyclophilin蛋白的激活。Avr3b能夠直接與大豆cyclophilin蛋白GmCYPl互作,并且該激活過程依賴于 GmCYP 1 的 PPIase 活性。Avr3b 含有一個 Glycine-Proline (GP) motif,而 GP motif通常是cyclophilin蛋白與它的蛋白底物的結(jié)合位點(diǎn)。實驗結(jié)果表明將Avr3b中GPmotif的第132位脯氨酸突變?yōu)楸彼釙䦟?dǎo)致Avr3b和GmCYP1之間的互作減弱,突變體Avr3bP132A不再能夠被GmCYP1激活同時也喪失了促進(jìn)植物感病性的能力。本研究也鑒定到煙草的cyclophilin蛋白NbCYP3/4也能夠與Avr3b互作并且激活它的Nudix水解酶活性。綜上所述,本研究揭示了 Avr3b通過招募植物cyclophilin蛋白激活自身Nudix水解酶活性的機(jī)理。GmCYP1參與Avr3b被抗病蛋白Rps3b的識別生物學(xué)過程。大豆疫霉無毒效應(yīng)分子Avr3b能夠在含抗病基因Rps3b的品種上引發(fā)特異的ETI反應(yīng),為檢測大豆GmCYP1蛋白是否也參與了該反應(yīng),本研究利用基因槍的方法同時向大豆細(xì)胞轟擊GmCYP1的沉默載體和Avr3b的瞬時表達(dá)載體,并檢測細(xì)胞死亡率。實驗表明在Rps3b抗病大豆葉片的基因槍轟擊區(qū)域,大豆內(nèi)源GmCYP1的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降,同時Avr3b引起的細(xì)胞死亡顯著減弱。藥理學(xué)試驗表明,在使用PPIase抑制劑CsA (20μM)抑制大豆葉片PPIase活性的情況下,Avr3b在含有Rps3b抗病大豆葉片上引發(fā)的細(xì)胞死亡率顯著下降,同時證明Avr3b無毒功能的激活也依賴于寄主的PPIase活性。進(jìn)一步試驗結(jié)果顯示,在抗病大豆上瞬時表達(dá)GP motif的突變體Avr3bP132A也不能夠誘導(dǎo)Rps3b介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。因此,以上結(jié)果揭示GmCYP1在Avr3b被Rps3b識別的過程中也是必需的。RXLR類Nudix蛋白是疫霉菌基因組中普遍存在的一類效應(yīng)分子。無毒基因往往在疫霉菌的不同種中是不保守的,本研究接下來在多個疫霉菌基因組中開展了 Avr3b同源基因的分析。通過搜索大豆疫霉、馬鈴薯晚疫病菌、辣椒疫霉和橡樹疫霉的基因組,我們發(fā)現(xiàn)這些疫霉種都含有Avr3b同源蛋白(RXLR-Nudix類效應(yīng)分子),其中大豆疫霉1個、馬鈴薯晚疫病菌5個、辣椒疫霉1個和橡樹疫霉3個,每一個RXLR-Nudix效應(yīng)分子的保守的Nudix motif都位于整個效應(yīng)分子的C端,但是他們的N端出現(xiàn)了更大的多態(tài)性。該結(jié)果提示該類效應(yīng)因子可能是一類古老的效應(yīng)因子,疫霉菌不同種可能利用相似的策略抑制植物免疫。真菌中也發(fā)現(xiàn)了分泌型的Nudix蛋白,與RXLR-Nudix效應(yīng)分子不同的是,這些效應(yīng)分子沒有RXLRmotif或W motif。序列分析發(fā)現(xiàn)疫霉菌RXLR-Nudix效應(yīng)分子和其他的Nudix效應(yīng)分子屬于不同的類別,并且各自獨(dú)立進(jìn)化。本研究結(jié)果表明不同類型的Nudix效應(yīng)分子進(jìn)化歷程并不相同,提示其在不同病原菌中可能具有不同的生物學(xué)功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S435.651

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