本文關(guān)鍵詞：雞鈉氫交換蛋白1介導(dǎo)的Wnt信號(hào)通路在J亞群禽白血病病毒感染中的作用　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：J亞群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J,ALV-J)能引起雞生長(zhǎng)遲緩、免疫抑制和腫瘤等疾病,給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失,目前尚無(wú)有效的疫苗和藥物予以防治,其感染致病機(jī)制亟須進(jìn)一步深入研究。雞鈉氫交換蛋白1(chicken sodium hydrogen exchanger isoform 1,ch NHE1)是普遍存在于真核細(xì)胞質(zhì)膜的一種跨膜蛋白,通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞外Na+和細(xì)胞內(nèi)H+的交換來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)p H值,在生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。ch NHE1同時(shí)也是ALV-J的受體,其在ALV-J感染中的作用至今未明。病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合是實(shí)現(xiàn)其感染的第一步,也是最為關(guān)鍵的一步。因此,明確ch NHE1在ALV-J感染過(guò)程中的功能變化及這種變化對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路與細(xì)胞表型的影響,對(duì)于解析ALV-J的致病機(jī)制及開發(fā)新的防控藥物至為重要。為此,我們首先設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究ALV-J是否對(duì)ch NHE1有調(diào)節(jié)作用,有何種調(diào)節(jié)作用。我們用103 TCID50的ALV-J病毒感染DF-1細(xì)胞,在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞;然后用101、103和104 TCID50的ALV-J毒株感染DF-1細(xì)胞,在感染后的72 h收集細(xì)胞;最后通過(guò)RT-PCR和real-time PCR技術(shù)檢測(cè)ALV-J和ch NHE1在m RNA水平的表達(dá)。結(jié)果顯示,ALV-J對(duì)ch NHE1的表達(dá)有上調(diào)作用,且ch NHE1的表達(dá)具有時(shí)間依賴性,呈現(xiàn)波浪式升高;但ch NHE1的表達(dá)無(wú)病毒滴度依賴性,104 TCID50感染時(shí)ch NHE1的表達(dá)量反而低于101和103 TCID50組。接下來(lái)我們應(yīng)用103 TCID50的ALV-J毒株感染DF-1細(xì)胞,在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p H值。結(jié)果顯示,ALV-J感染可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)p H快速升高,至24 h時(shí)達(dá)到7.7,隨后在72 h和120 h時(shí)略有下降,說(shuō)明ALV-J可通過(guò)上調(diào)ch NHE1表達(dá)而升高細(xì)胞內(nèi)p H。最后我們通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ALV-J對(duì)ch NHE1的調(diào)節(jié)。成功建立ALV-J感染SPF雞模型后,選取腎臟組織提取RNA,經(jīng)RT-PCR和real-time PCR檢測(cè)ALV-J和ch NHE1在m RNA水平的表達(dá)。結(jié)果顯示,接毒組中ch NHE1的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。我們進(jìn)一步通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)ch NHE1在不同組織中的表達(dá)與分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在腎臟、肝臟、骨髓和胸腺等組織中,ALV-J感染組中ch NHE1的蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組;而在脾臟和法氏囊組織中,ch NHE1的表達(dá)沒(méi)有明顯的變化�？傊�,本實(shí)驗(yàn)證明ALV-J感染能上調(diào)ch NHE1的表達(dá)與功能,并推測(cè)ch NHE1的上調(diào)在ALV-J誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。ALV-J與ch NHE1結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞,通過(guò)宿主基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯及病毒的組裝釋放,在這個(gè)過(guò)程中多種信號(hào)通路發(fā)揮了重要作用。既往研究表明,Wnt信號(hào)通路涉及多種病毒的感染,但其在ALV-J感染中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為證明ALV-J感染是否對(duì)Wnt通路有調(diào)節(jié)作用,有何種調(diào)節(jié)作用,我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF細(xì)胞,在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用western blot技術(shù)檢測(cè)β-catenin的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ALV-J感染會(huì)導(dǎo)致β-catenin蛋白表達(dá)水平下降;與此同時(shí)我們檢測(cè)了ALV-J感染后120 h細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的表達(dá),結(jié)果顯示,ALV-J感染細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)水平也顯著低于對(duì)照組。然后我們用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF細(xì)胞,在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Tcf1、Tcf4和Lef1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ALV-J感染顯著抑制了Tcf4和Lef1的表達(dá),而Tcf1的表達(dá)無(wú)顯著降低。接下來(lái)我們檢測(cè)了Wnt通路下游的靶基因,應(yīng)用103TCID50的ALV-J毒株感染CEF細(xì)胞,在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)Axin2、Cyclin D1、c-myc和MMP-7在m RNA水平的表達(dá)。結(jié)果顯示,ALV-J感染下調(diào)了Axin2和Cyclin D1的表達(dá),而與腫瘤發(fā)生相關(guān)的c-myc和MMP-7的表達(dá)發(fā)生了上調(diào)。我們進(jìn)一步檢測(cè)了ALV-J感染后的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡,應(yīng)用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF細(xì)胞,于感染后48 h通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,G2/M期細(xì)胞所占比例出現(xiàn)明顯上升,表明細(xì)胞周期受到阻滯。我們應(yīng)用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF細(xì)胞,在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ALV-J感染能夠抑制細(xì)胞增殖,在第5 d和第7 d,感染組細(xì)胞的增殖速率顯著低于對(duì)照組,表明細(xì)胞增殖受到抑制。最后我們?cè)O(shè)計(jì)了相關(guān)體內(nèi)實(shí)驗(yàn),通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)β-catenin在肌肉、法氏囊和脾臟組織中的表達(dá)與分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)于肌肉組織,ALV-J感染后β-catenin的表達(dá)顯著低于對(duì)照組;對(duì)于法氏囊組織,β-catenin在對(duì)照組法氏囊皮質(zhì)和髓質(zhì)交界處網(wǎng)狀細(xì)胞呈高表達(dá),而ALV-J感染后其表達(dá)出現(xiàn)明顯下降;對(duì)于脾臟組織,β-catenin在對(duì)照組血管內(nèi)皮細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞、紅髓部位呈高表達(dá),而ALV-J感染后其表達(dá)出現(xiàn)明顯下降。以上實(shí)驗(yàn)證明ALV-J感染后能下調(diào)Wnt信號(hào)通路,且Wnt通路下調(diào)可能是導(dǎo)致雞生長(zhǎng)遲緩和免疫抑制的機(jī)制之一。為研究ALV-J感染時(shí)ch NHE1通過(guò)何種機(jī)制下調(diào)Wnt信號(hào)通路,我們首先用103TCID50的ALV-J毒株感染CEF細(xì)胞,在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用western blot技術(shù)檢測(cè)GSK3β、p-GSK3β-ser9和p-GSK3β-tyr216的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GSK3β蛋白表達(dá)水平并未發(fā)生明顯變化;p-GSK3β-ser9蛋白在ALV-J感染前期并未出現(xiàn)明顯變化,僅在120 h時(shí)出現(xiàn)上調(diào);而p-GSK3β-tyr216蛋白在ALV-J感染后出現(xiàn)顯著上調(diào)。為探尋何種機(jī)制導(dǎo)致p-GSK3β-tyr216表達(dá)上調(diào),我們用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF細(xì)胞,在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)western blot技術(shù)檢測(cè)p-PYK2和ERK的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ALV-J感染后p-PYK2蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下降,而ERK蛋白表達(dá)水平在ALV-J感染后并未出現(xiàn)明顯變化。接下來(lái)我們用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF細(xì)胞,在感染后的6 h時(shí)通過(guò)活細(xì)胞工作站檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ALV-J感染導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度顯著上升。最后我們通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了相關(guān)驗(yàn)證。選取ALV-J感染組與對(duì)照組雞的肌肉組織,應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)p-GSK3β-tyr216在肌肉組織中的表達(dá)與分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ALV-J感染組中p-GSK3β-tyr216的表達(dá)顯著高于對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)證明ALV-J感染能引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高和p-GSK3β-tyr216表達(dá)上調(diào),進(jìn)而導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路下調(diào),并推測(cè)ch NHE1介導(dǎo)Wnt信號(hào)通路下調(diào)可能是ALV-J誘導(dǎo)雞生長(zhǎng)遲緩的重要機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.31

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