本文關鍵詞：雞鈉氫交換蛋白1介導的Wnt信號通路在J亞群禽白血病病毒感染中的作用　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 雞鈉氫交換蛋白1 J亞群禽白血病病毒 Wnt信號通路 p H 生長遲緩 免疫抑制 腫瘤

【摘要】：J亞群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J,ALV-J)能引起雞生長遲緩、免疫抑制和腫瘤等疾病,給我國養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟損失,目前尚無有效的疫苗和藥物予以防治,其感染致病機制亟須進一步深入研究。雞鈉氫交換蛋白1(chicken sodium hydrogen exchanger isoform 1,ch NHE1)是普遍存在于真核細胞質(zhì)膜的一種跨膜蛋白,通過介導細胞外Na+和細胞內(nèi)H+的交換來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)p H值,在生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。ch NHE1同時也是ALV-J的受體,其在ALV-J感染中的作用至今未明。病毒與宿主細胞受體結(jié)合是實現(xiàn)其感染的第一步,也是最為關鍵的一步。因此,明確ch NHE1在ALV-J感染過程中的功能變化及這種變化對細胞內(nèi)信號通路與細胞表型的影響,對于解析ALV-J的致病機制及開發(fā)新的防控藥物至為重要。為此,我們首先設計實驗研究ALV-J是否對ch NHE1有調(diào)節(jié)作用,有何種調(diào)節(jié)作用。我們用103 TCID50的ALV-J病毒感染DF-1細胞,在感染后的不同時間點收集細胞;然后用101、103和104 TCID50的ALV-J毒株感染DF-1細胞,在感染后的72 h收集細胞;最后通過RT-PCR和real-time PCR技術檢測ALV-J和ch NHE1在m RNA水平的表達。結(jié)果顯示,ALV-J對ch NHE1的表達有上調(diào)作用,且ch NHE1的表達具有時間依賴性,呈現(xiàn)波浪式升高;但ch NHE1的表達無病毒滴度依賴性,104 TCID50感染時ch NHE1的表達量反而低于101和103 TCID50組。接下來我們應用103 TCID50的ALV-J毒株感染DF-1細胞,在感染后的不同時間點通過熒光分光光度計檢測細胞內(nèi)p H值。結(jié)果顯示,ALV-J感染可導致細胞內(nèi)p H快速升高,至24 h時達到7.7,隨后在72 h和120 h時略有下降,說明ALV-J可通過上調(diào)ch NHE1表達而升高細胞內(nèi)p H。最后我們通過體內(nèi)實驗驗證ALV-J對ch NHE1的調(diào)節(jié)。成功建立ALV-J感染SPF雞模型后,選取腎臟組織提取RNA,經(jīng)RT-PCR和real-time PCR檢測ALV-J和ch NHE1在m RNA水平的表達。結(jié)果顯示,接毒組中ch NHE1的表達量顯著高于對照組。我們進一步通過免疫組織化學技術檢測ch NHE1在不同組織中的表達與分布。實驗結(jié)果顯示,在腎臟、肝臟、骨髓和胸腺等組織中,ALV-J感染組中ch NHE1的蛋白表達顯著高于對照組;而在脾臟和法氏囊組織中,ch NHE1的表達沒有明顯的變化�？傊�,本實驗證明ALV-J感染能上調(diào)ch NHE1的表達與功能,并推測ch NHE1的上調(diào)在ALV-J誘導腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。ALV-J與ch NHE1結(jié)合后進入細胞,通過宿主基因組進行轉(zhuǎn)錄、翻譯及病毒的組裝釋放,在這個過程中多種信號通路發(fā)揮了重要作用。既往研究表明,Wnt信號通路涉及多種病毒的感染,但其在ALV-J感染中的研究尚未見報道。為證明ALV-J感染是否對Wnt通路有調(diào)節(jié)作用,有何種調(diào)節(jié)作用,我們設計了以下實驗。應用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF細胞,在感染后的不同時間點應用western blot技術檢測β-catenin的表達。實驗結(jié)果顯示,ALV-J感染會導致β-catenin蛋白表達水平下降;與此同時我們檢測了ALV-J感染后120 h細胞核內(nèi)β-catenin的表達,結(jié)果顯示,ALV-J感染細胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達水平也顯著低于對照組。然后我們用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF細胞,在感染后的不同時間點應用real-time PCR技術檢測轉(zhuǎn)錄因子Tcf1、Tcf4和Lef1的表達。實驗結(jié)果顯示,ALV-J感染顯著抑制了Tcf4和Lef1的表達,而Tcf1的表達無顯著降低。接下來我們檢測了Wnt通路下游的靶基因,應用103TCID50的ALV-J毒株感染CEF細胞,在感染后的不同時間點應用real-time PCR技術檢測Axin2、Cyclin D1、c-myc和MMP-7在m RNA水平的表達。結(jié)果顯示,ALV-J感染下調(diào)了Axin2和Cyclin D1的表達,而與腫瘤發(fā)生相關的c-myc和MMP-7的表達發(fā)生了上調(diào)。我們進一步檢測了ALV-J感染后的細胞周期與細胞凋亡,應用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF細胞,于感染后48 h通過流式細胞術檢測細胞周期。實驗結(jié)果顯示,G2/M期細胞所占比例出現(xiàn)明顯上升,表明細胞周期受到阻滯。我們應用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF細胞,在感染后的不同時間點應用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖。實驗結(jié)果顯示,ALV-J感染能夠抑制細胞增殖,在第5 d和第7 d,感染組細胞的增殖速率顯著低于對照組,表明細胞增殖受到抑制。最后我們設計了相關體內(nèi)實驗,通過免疫組織化學技術檢測β-catenin在肌肉、法氏囊和脾臟組織中的表達與分布。實驗結(jié)果顯示,對于肌肉組織,ALV-J感染后β-catenin的表達顯著低于對照組;對于法氏囊組織,β-catenin在對照組法氏囊皮質(zhì)和髓質(zhì)交界處網(wǎng)狀細胞呈高表達,而ALV-J感染后其表達出現(xiàn)明顯下降;對于脾臟組織,β-catenin在對照組血管內(nèi)皮細胞、竇內(nèi)皮細胞、紅髓部位呈高表達,而ALV-J感染后其表達出現(xiàn)明顯下降。以上實驗證明ALV-J感染后能下調(diào)Wnt信號通路,且Wnt通路下調(diào)可能是導致雞生長遲緩和免疫抑制的機制之一。為研究ALV-J感染時ch NHE1通過何種機制下調(diào)Wnt信號通路,我們首先用103TCID50的ALV-J毒株感染CEF細胞,在感染后的不同時間點應用western blot技術檢測GSK3β、p-GSK3β-ser9和p-GSK3β-tyr216的表達。實驗結(jié)果顯示,GSK3β蛋白表達水平并未發(fā)生明顯變化;p-GSK3β-ser9蛋白在ALV-J感染前期并未出現(xiàn)明顯變化,僅在120 h時出現(xiàn)上調(diào);而p-GSK3β-tyr216蛋白在ALV-J感染后出現(xiàn)顯著上調(diào)。為探尋何種機制導致p-GSK3β-tyr216表達上調(diào),我們用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF細胞,在感染后的不同時間點通過western blot技術檢測p-PYK2和ERK的表達。實驗結(jié)果顯示,ALV-J感染后p-PYK2蛋白表達水平出現(xiàn)下降,而ERK蛋白表達水平在ALV-J感染后并未出現(xiàn)明顯變化。接下來我們用103 TCID50的ALV-J毒株感染CEF細胞,在感染后的6 h時通過活細胞工作站檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。實驗結(jié)果顯示,ALV-J感染導致細胞內(nèi)Ca2+的濃度顯著上升。最后我們通過體內(nèi)實驗進行了相關驗證。選取ALV-J感染組與對照組雞的肌肉組織,應用免疫組織化學技術檢測p-GSK3β-tyr216在肌肉組織中的表達與分布。實驗結(jié)果顯示,ALV-J感染組中p-GSK3β-tyr216的表達顯著高于對照組。本實驗證明ALV-J感染能引起細胞內(nèi)Ca2+濃度升高和p-GSK3β-tyr216表達上調(diào),進而導致Wnt信號通路下調(diào),并推測ch NHE1介導Wnt信號通路下調(diào)可能是ALV-J誘導雞生長遲緩的重要機制。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31

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