本文關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒S基因變異分析及嗜酸乳桿菌口服疫苗的研究　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病。豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是一種有囊膜的單鏈RNA病毒,屬冠狀病毒科冠狀病毒亞科α冠狀病毒屬成員。在中國,PED已在多個豬的主產(chǎn)省報道,7日齡內(nèi)哺乳仔豬病死率高達(dá)90-100%,通常出生后2-3天開始發(fā)病。盡管有疫苗可用,但作為中國生豬生產(chǎn)大省,山東省因為這些新PED的暴發(fā)仍遭受了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。自2012以來,山東省許多豬場PED暴發(fā)明顯增加,這給養(yǎng)豬業(yè)帶來了沉重打擊。為了解山東省規(guī)�；i場PEDV的流行情況和變異規(guī)律,探究針對當(dāng)前流行的主要基因型PEDV的新型有效口服疫苗,本研究進(jìn)行了以下幾個方面的工作:2012年1月至2015年7月,我們首先在山東省開展PEDV分子流行病學(xué)研究,一共采集了205份PEDV可疑病料,RT-PCR檢出146份陽性,檢出率為71.2%。利用RT-PCR擴(kuò)增和DNAstar軟件拼接,得到來自13個不同地市的38株P(guān)EDV完整的S基因序列,序列長度在4149-4161bp之間,氨基酸序列在1381-1386aa之間,彼此核苷酸同源性為95.0%-99.9%,氨基酸同源性為94.3%-99.8%,這38株病毒根據(jù)S基因長度不同分屬于進(jìn)化樹G2和G3分支。進(jìn)化樹是用從NCBI數(shù)據(jù)庫選取41株具有代表性的參考毒株與本研究獲得的38株P(guān)EDV的S基因序列做遺傳進(jìn)化分析所得,它分為三支:G1、G2和G3。G1主要是傳統(tǒng)毒株和疫苗株,G2包含7株本研究獲得的來自山東省4株不同地市流行株。G3包含56株當(dāng)前流行株,其中31株來自于本研究,剩余25個分別為17株中國流行株、3株韓國流行毒株和5株美國流行毒株。G3中野毒株的S基因序列長度大都為4161bp,但是其中的Gd分支屬于例外,S序列長度都為4158bp。本研究2014年獲得的2株臨沂地區(qū)的流行毒株(CH-SDLY-2-2014和CH-SDLY-3-2014)位于Gd分支,是華北地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)。G3中的31株流行株占據(jù)省內(nèi)12個不同地市,是當(dāng)前山東省PEDV流行株的主要基因型。根據(jù)遺傳進(jìn)化分析結(jié)果摘選代表序列做抗原位點的氨基酸同源性比對發(fā)現(xiàn),PEDV的S蛋白變異區(qū)主要集中在COE位點,且變異位點較多,這可能是最近幾年豬流行性腹瀉頻繁暴發(fā)的主要原因之一。通過遺傳分析我們得出結(jié)論山東省2012-2015年同時存在2個基因型G2和G3(包含Gd)的PEDV。利用32對引物擴(kuò)增出CH-SDLY-2014株的全基因組序列28035nt,沒有poly(A),基因組為典型的冠狀病毒科結(jié)構(gòu)。CH-SDLY-2014株與選取的國內(nèi)外PEDV代表毒株進(jìn)行核苷酸同源性比對顯示,全基因組序列同源性在96.6-99.0%之間,S基因的序列同源性是93.5-98.5%。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果可知全基因組的進(jìn)化樹分為3個組:G1、G2和G3,其中G3包含2個分支3a與3b。CH-SDLY-2014株與6株華南PEDV流行株同源性較高,聚類在3a分支中。S基因遺傳進(jìn)化分析得到的進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與全基因組的結(jié)構(gòu)相似,CH-SDLY-2014株也聚類在3a中。值得關(guān)注的是,3b分支中各流行株的S基因全長都為4161 nt,而3a中的S基因展示了4158 nt長的序列,是我國北方地區(qū)第一次分離得到。3a分支中包含14株2011年后分離到的野毒株,其中CH-SDLY-2014株剛從中國北方分離到,12株來自中國南方,還有1株源于南亞。這些3a中的S基因序列有特異性,在其3’碳端與傳統(tǒng)CV777株S基因?qū)?yīng)的3580-3582 nt位置,存在3個核苷酸的缺失。這一特性或許可以作為3a分支區(qū)別其他PEDV流行株基因型的鑒別依據(jù)。S蛋白位于PEDV病毒粒子的表面,除了在介導(dǎo)免疫方面的作用外,還具有促進(jìn)融合病毒與細(xì)胞膜、識別靶細(xì)胞等其它生物學(xué)作用,成為研制防疫PEDV新型有效疫苗的主要的目的蛋白。本研究選取編碼主要抗原位點基因,用p ET-30a構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coli BL21進(jìn)行體外誘導(dǎo)表達(dá)。通過對表達(dá)時間,誘導(dǎo)劑用量和溫度等條件的優(yōu)化,SPEDV蛋白獲得成功表達(dá)(最佳的表達(dá)方案:重組菌用1 m M的IPTG誘導(dǎo),在37℃條件下培養(yǎng)4小時)。利用純化的目的蛋白作為包被抗原,經(jīng)過一系列條件的優(yōu)化,我們初步建立了檢測SPEDV蛋白抗體的間接ELISA方法。乳酸桿菌作為基因工程疫苗研究的受體菌可以將乳酸桿菌自身的生物學(xué)功能與外源基因的特異性免疫功能相結(jié)合,從而增強(qiáng)動物機(jī)體非特異性免疫和特異性免疫。本研究中,我們將構(gòu)建的p Rc/CMV2-S1-Rep.8014和p Rc/CMV2-S2-Rep.8014重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到L.acidophilus 1C1中,研制了表達(dá)PEDV S1(2)蛋白的重組乳酸桿菌疫苗。通過多組動物實驗的口服免疫,檢測體液和細(xì)胞免疫指標(biāo),探究該疫苗的免疫效果。BALB/c小鼠分別免疫重組L.acidophilus 1C1:p Rc/CMV2-S1(2)-Rep.8014、p Rc/CMV2-S1-Rep.8014和p Rc/CMV2-S2-Rep.8014口服疫苗,并設(shè)置PBS、p Rc/CMV2和商品疫苗免疫對照組。收集血清、小腸和糞便樣品,分離血清用于檢測特異性Ig G抗體,而小腸和糞便標(biāo)本用于檢測SIg A抗體。試驗結(jié)果表明,口服疫苗組Ig G抗體水平均低于商品疫苗組(p0.05),但是口服疫苗組SIg A抗體水平明顯高于商品疫苗組(p0.01)。免疫p Rc/CMV2-S1(2)-Rep.8014口服疫苗的小鼠脾細(xì)胞CD4+和CD8+T細(xì)胞百分比顯著高于與其他組(p0.05)。ELISA法檢測免疫小鼠血清中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和Th2型細(xì)胞因子IL-4,結(jié)果表明口服疫苗具有一定的免疫效果,不僅提高了小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答,而且增強(qiáng)了小鼠的體液免疫應(yīng)答。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,NGS技術(shù)在各環(huán)境內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)和功能的研究領(lǐng)域中產(chǎn)生了翻天覆地的影響。Rarefaction curve反映樣本中數(shù)據(jù)量已經(jīng)足夠,且S1和S2組早期和晚期的樣品多樣性指數(shù)低于中期。微生物菌群組成S1和S2組成相似,C的組成與其他兩組最不相似。群落結(jié)構(gòu)組成分析發(fā)現(xiàn)免疫后的小鼠腸道內(nèi)厚壁菌門是豐度較高的8個門之一,厚壁菌門的乳桿菌屬位于豐度較高的5個屬之一。實驗組S1和S2小鼠腸道內(nèi)重組乳酸桿菌的比例隨時間的推移出現(xiàn)下降趨勢,因此建議補(bǔ)充第三次重組乳酸桿菌口服疫苗的免疫,或許對抗體水平的維持或提高有所改進(jìn)。
[Abstract]:The epidemic diarrhea virus ( PED ) is a highly contagious intestinal infectious disease caused by porcine epidemic diarrhea virus ( PEDV ) , which is characterized by diarrhea , vomiting , dehydration and high mortality rate . In this study , we concluded that there were 2 genotypes G2 and G3 ( including Gd ) in three groups : G1 , G2 and G3 . In this study , we have established a recombinant lactobacillus vaccine expressing PEDV S1 ( 2 ) . The results show that the levels of CD4 + and CD8 + T cells in the immunized mice are lower than those in other groups ( P < 0.01 ) .

【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：1374201