本文關(guān)鍵詞：新城疫病毒HN基因重組乳酸菌抗小鼠結(jié)腸癌及免疫機(jī)制的初步研究　出處：《吉林大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：結(jié)腸癌是一種常見的高發(fā)性消化道癌癥，結(jié)腸癌因腫瘤本身及患病機(jī)體年齡、營(yíng)養(yǎng)狀況等因素而常發(fā)生免疫抑制。結(jié)腸癌潛在的免疫原性和機(jī)體的免疫反應(yīng)會(huì)影響機(jī)體的生存時(shí)間。因此，任何能夠提高腫瘤免疫原性、激發(fā)或重塑機(jī)體免疫系統(tǒng)、阻止機(jī)體免疫抑制的出現(xiàn)，都將有助于排斥或摧毀腫瘤細(xì)胞，是癌癥免疫治療的重要策略。 新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）囊膜表面的血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白（HN）是病毒感染入侵宿主的重要工具，也是病毒發(fā)揮抗腫瘤作用的重要功能蛋白。隨著乳酸菌原核表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展成熟，乳酸菌已成為功能蛋白基因的重要運(yùn)載工具，在介導(dǎo)消化道局部免疫，影響全身性免疫調(diào)節(jié)方面具有突出的益生優(yōu)勢(shì)。其中乳酸桿菌以其特有的免疫刺激活性和對(duì)腸黏膜的持續(xù)黏附活性，逐漸成為一類重要的工程菌株替代其他益生菌株。 為此，本研究克隆了NDV HN基因，利用實(shí)驗(yàn)室成功改造可錨定表達(dá)于細(xì)胞膜的乳酸菌表達(dá)載體pSIP409，構(gòu)建HN-pSIP409重組體，采用電轉(zhuǎn)化技術(shù)，將HN-pSIP409重組體電轉(zhuǎn)化到受體菌-植物乳桿菌（Lactobacillus plantanrumNC8）感受態(tài)中。利用SDS-PAGE和免疫印跡，檢測(cè)HN蛋白的表達(dá)情況。為明確HN蛋白表達(dá)位置，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了重組菌菌體細(xì)胞表面HN蛋白的表達(dá)情況。為便于檢測(cè)重組菌的穩(wěn)定性，在HN基因下游插入了綠色熒光蛋白（GFP）基因，構(gòu)建了具有熒光效應(yīng)的HN基因重組乳酸菌，通過菌體熒光效應(yīng)檢測(cè)GFP基因的表達(dá)情況及重組菌的穩(wěn)定性。結(jié)果成功構(gòu)建了新城疫病毒HN基因重組乳酸菌（簡(jiǎn)稱重組菌），SDS-PAGE、Western blotting檢測(cè)可見在66kDa附近有免疫印跡條帶，表明表達(dá)的HN蛋白具有反應(yīng)原性；流式檢測(cè)結(jié)果表明HN蛋白可以表達(dá)于菌體細(xì)胞表面，有利于與腸黏膜表面接觸和刺激樹突狀細(xì)胞活化。穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果表明串聯(lián)表達(dá)GFP基因的重組菌傳30代依然可見其熒光效應(yīng)。 研究顯示，經(jīng)常飲食乳酸菌發(fā)酵的乳制品常與結(jié)腸癌低發(fā)生率有密切聯(lián)系。盡管目前尚無明確機(jī)制的研究，但很多研究已證實(shí)乳酸菌能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻斷致癌物誘變作用及誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫效應(yīng)，因而在預(yù)防或抑制腫瘤發(fā)生方面具有重要的研究意義。而新城疫病毒HN蛋白分子除了能吸附和水解腫瘤細(xì)胞表面的唾液酸受體，更重要的是能夠激活及增強(qiáng)固有免疫以防御腫瘤。 為明確HN蛋白能否協(xié)同增強(qiáng)乳酸菌的抗腫瘤功能，我們提前2周給荷瘤鼠分別灌胃109CFU的重組菌（命名為HN/Lab）和植物乳桿菌（Lactobacillusplantanrum NC8，命名為L(zhǎng).p）。此后，通過腫瘤誘導(dǎo)建立了皮下結(jié)腸癌移植瘤、原位移植瘤及腸外肺轉(zhuǎn)移瘤模型，并在腫瘤誘導(dǎo)后每周加強(qiáng)免疫1次、連續(xù)免疫3周，評(píng)價(jià)重組菌抗腫瘤效果如下： （1）通過評(píng)估重組菌對(duì)皮下移植瘤的抑瘤效果，我們檢測(cè)到了重組菌HN/Lab（CT26+HN/Lab組）能明顯抑制荷瘤鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng)，與模型組（CT26組）相比，分別在腫瘤誘導(dǎo)后25d、30d差異顯著（p0.05），小鼠的存活率和生存時(shí)間也顯著高于CT26組（p0.05）；腫瘤病理組織學(xué)檢測(cè)顯示重組菌HN/Lab處理組小鼠腫瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。植物乳桿菌組（CT26+L.p組）小鼠在腫瘤誘導(dǎo)25天后，其抑瘤效果沒有CT26+HN/Lab組明顯。 （2）監(jiān)測(cè)重組菌對(duì)小鼠原位結(jié)腸癌移植瘤的抑制效果，結(jié)果顯示重組菌HN/Lab在腫瘤誘導(dǎo)后7d即能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)（p0.05），而植物乳桿菌也有抑制作用但未達(dá)到差異顯著水平；經(jīng)初步計(jì)算重組菌HN/Lab抑瘤率為43.13%，與植物乳桿菌23.03%抑瘤率相比有了明顯的提高；腸道腫瘤病理組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示重組菌HN/Lab誘導(dǎo)腫瘤壞死明顯、且浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞也顯著增多，能夠抑制腫瘤細(xì)胞向黏膜層方向轉(zhuǎn)移，腸道病理評(píng)分明顯降低。 （3）通過比較腸外肺轉(zhuǎn)移模型肺臟腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量，表明CT26+HN/Lab和CT26+L.p組肺臟腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量均明顯降低，其中重組菌組與模型組相比差異顯著，表明重組菌HN/Lab對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用。 通過檢測(cè)重組菌的抑瘤效果，我們發(fā)現(xiàn)無論重組菌和植物乳桿菌（受體菌）是否與腫瘤細(xì)胞有直接的接觸，它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)都有抑制作用，說明它們可能是通過影響機(jī)體的免疫反應(yīng)發(fā)揮了作用。研究已經(jīng)證實(shí)HN蛋白能夠有效的刺激I型IFN（IFN-、IFN-β和TNF-）的產(chǎn)生和釋放從而激活NK細(xì)胞的殺傷活性，且這種活性的發(fā)揮可以不依賴病毒的復(fù)制。而單獨(dú)口服乳酸菌后能夠有效地誘導(dǎo)DCs的活化，促進(jìn)DCs的成熟，從而產(chǎn)生兩方面效應(yīng)：一方面激活NK細(xì)胞，NK細(xì)胞即可產(chǎn)生殺傷腫瘤效應(yīng)，后者通過分泌IFN-γ等細(xì)胞因子又會(huì)進(jìn)一步活化DCs，形成一個(gè)緊密的cross talk；另一方面，活化DCs還會(huì)調(diào)節(jié)Th細(xì)胞的分化，影響（可能抑制或促進(jìn)）腫瘤生長(zhǎng)，分化的趨勢(shì)與菌株個(gè)體有著密切的聯(lián)系。因此我們推測(cè)重組菌主要通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫而發(fā)揮作用。 為進(jìn)一步驗(yàn)證我們的假設(shè)，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)、ELISA及免疫組化等技術(shù)檢測(cè)了重組菌對(duì)NK細(xì)胞活化及殺傷效應(yīng)的影響，評(píng)估了重組菌誘導(dǎo)DCs的活化以及對(duì)CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞相對(duì)數(shù)量、分化及殺傷活性的影響，并檢測(cè)了重組菌對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的影響，即檢測(cè)了結(jié)腸癌荷瘤鼠腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）種類、相對(duì)數(shù)量及殺傷活性的影響，結(jié)果如下： （1）采用ELISA檢測(cè)在腫瘤誘導(dǎo)前后，灌服重組菌HN/Lab均能夠促進(jìn)脾臟中I型細(xì)胞因子包括IFN-γ和TFN-的表達(dá)，提高脾臟中NK細(xì)胞的比例及提高NK細(xì)胞中IFN-γ和顆粒霉素B的分泌，體外殺傷實(shí)驗(yàn)表明NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性也得到顯著提高。表明重組菌能夠誘導(dǎo)NK細(xì)胞的增殖及活化，發(fā)揮抗腫瘤作用。 （2）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到重組菌可以提高脾臟中CD4+T細(xì)胞的比例（p0.05），對(duì)CD8+T細(xì)胞的比例影響并不明顯，表明重組菌主要誘導(dǎo)以Th細(xì)胞為主的反應(yīng)。為進(jìn)一步研究Th細(xì)胞的極化，我們首先檢測(cè)重組菌對(duì)DCs活化的影響，，結(jié)果表明，重組菌可以促進(jìn)B7分子CD80和CD86的表達(dá)而介導(dǎo)DCs的成熟分化，且成熟的DCs與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后可上調(diào)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)，而對(duì)IL-4（Th2型）或IL-17（Th17型）表達(dá)影響并不顯著，說明重組菌主要誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th1方向極化而發(fā)揮抗腫瘤作用。盡管重組菌沒有明顯提高CD8+T細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量，但促進(jìn)了CD8+T分泌IFN-γ和顆粒霉素B的數(shù)量（p0.05），而植物乳桿菌主要促進(jìn)CD8+T分泌IFN-γ，說明重組菌可以顯著提高CD8+T細(xì)胞殺傷活性，有利于產(chǎn)生抑瘤效應(yīng)。 （3）流式細(xì)胞術(shù)及免疫組化結(jié)果表明，重組菌能夠提高腫瘤組織中浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞比例，其中NK細(xì)胞數(shù)量顯著增多（p0.05），特別是明顯提高分泌顆粒霉素B的CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞的比例（p0.05），表明重組菌HN/Lab能夠促進(jìn)CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞向腫瘤組織遷移并提高其殺傷活性，而改變腫瘤組織微環(huán)境，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。 綜上，本研究構(gòu)建了表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組乳酸菌，其對(duì)建立的鼠結(jié)腸癌實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂休^好的抑制作用，且主要通過促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和活化、誘導(dǎo)DCs成熟、促進(jìn)CD4+Th1分化、提高CD8+T細(xì)胞殺傷活性以及促進(jìn)上述免疫活性細(xì)胞向腫瘤組織浸潤(rùn)，而發(fā)揮了綜合抗腫瘤免疫效應(yīng)。為重組乳酸菌誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫及其機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S857.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 雷春龍;董國(guó)忠;;腸道菌群對(duì)動(dòng)物腸黏膜免疫的調(diào)控作用[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2012年03期

2 倪艷艷;范躍祖;;結(jié)腸癌動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J];同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年02期

3 辛磊;柏愚;李兆申;;結(jié)直腸癌危險(xiǎn)因素研究進(jìn)展[J];中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志;2014年12期

本文編號(hào)：1337322