本文關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦絲氨酸蛋白酶抑制因子（Serpins）的鑒定及調(diào)控功能研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：凡納濱對蝦,也稱之為南美白對蝦,是我國重要的養(yǎng)殖蝦類。近年來,由于疾病頻頻爆發(fā),我國乃至全球?qū)ξr養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)都遭受了巨大損失。因此,在加強病害防治的同時,更要加大對蝦基礎(chǔ)免疫的研究,為對蝦抗病育種奠定分子基礎(chǔ)。作為低等的無脊椎動物,凡納濱對蝦只能依賴于先天免疫系統(tǒng)來抵御病原的入侵。病原入侵后激活Toll/IMD通路以及酚氧化酶原系統(tǒng),通過誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽以及發(fā)生黑化反應(yīng)來殺滅病原。在這些免疫應(yīng)激反應(yīng)被激活的過程中,都需要絲氨酸蛋白酶的參與。然而,過多被激活的蛋白酶會對機體自身造成損害,引發(fā)對蝦死亡,必須加以嚴(yán)格調(diào)控,做到按需激活。絲氨酸蛋白酶抑制因子serpin,能夠通過對蛋白酶的特異性抑制,進而有效調(diào)控蛋白酶激活。本研究利用同源克隆結(jié)合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)、RACE技術(shù),從凡納濱對蝦分離鑒定出4種serpin基因,并對其進行生物信息學(xué)分析;利用實時熒光定量PCR技術(shù),從mRNA水平對4個serpin基因的表達譜進行分析;構(gòu)建EGFP融合表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染果蠅S2細胞,分析serpin基因的亞細胞定位;過表達serpin基因,利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng),檢測serpin基因?qū)咕膯幼踊钚缘挠绊?體外合成雙鏈RNA,利用RNA干擾技術(shù)沉默serpins表達后,探究其與通路相關(guān)基因的表達調(diào)控關(guān)系;構(gòu)建原核表達載體,誘導(dǎo)表達、純化得到4個serpin基因的重組蛋白,進行體外活性分析;定點突變serpinB3 P1P1’位點,分析P1P1’位點對蛋白酶抑制的選擇特異性;利用GST Pull-down技術(shù),檢測與serpinB3結(jié)合的靶蛋白;利用抗體雜交進一步分析serpinB3與蛋白酶的作用機制,獲得的主要研究結(jié)果如下:1.利用同源克隆和RACE技術(shù)從凡納濱對蝦克隆得到四個serpin基因,分別命名為Lvserpin3、Lvserpin7、Lvserpin8、LvserpinB3。四個serpin基因都含有信號肽序列、serpin結(jié)構(gòu)域、反應(yīng)中心環(huán)(RCL)以及典型的7-8個α-螺旋以及3個β-折疊,其中,LvserpinB3在其N末端具有一個跨膜結(jié)構(gòu)域。2.共聚焦顯微觀測結(jié)果顯示,與EGFP組相比,Lvserpin3定位在整個細胞,LvserpinB3主要定位在線粒體。在果蠅S2細胞過表達Lvserpin3,引起果蠅抗菌肽Attacin A啟動子活性顯著降低,過表達LvserpinB3后引起凡納濱對蝦抗菌肽Penaeidin4啟動子活性顯著下降。對啟動子活性的抑制表明Lvserpin3和LvserpinB3能夠參與對一些抗菌肽生成的調(diào)控,進而參與到對蝦的抗菌免疫。3.凡納濱對蝦lvserpin3、lvserpin8和lvserpinb3在肝胰腺中表達量最高,lvserpin7在血細胞中表達量最高;在注射鰻弧菌后,lvserpin3基因的mrna表達量在感染早期顯著上調(diào),lvserpin7、lvserpin8及l(fā)vserpinb3在感染的后期,表達量極顯著高于對照組。在注射溶壁微球菌后,lvserpin3和lvserpin7基因的mrna表達量在感染早期顯著上調(diào),而lvserpin8及l(fā)vserpinb3在感染的后期表達量顯著上調(diào)。在注射wssv中后期,lvserpin3、lvserpin7、lvserpin8及l(fā)vserpinb3表達量都有顯著地上調(diào)。利用dsrna干擾技術(shù)沉默lvserpin3表達后感染鰻弧菌,引起酚氧化酶原激活因子(lvppaf)和酚氧化酶原(lvpropo)的mrna表達量顯著上調(diào),血液酚氧化酶活力(po)顯著上升;沉默lvserpin7后,lvppaf和酚氧化酶原激酶(lvppae)的mrna表達量顯著上升;沉默lvserpin8后,酚氧化酶原激酶2(lvppae2)的mrna表達量顯著上升;沉默lvserpinb3后,絲氨酸蛋白酶1(lvsp1)和lvppae2的mrna表達量顯著增加。此外,沉默4個serpin都引起對蝦累積死亡率顯著上升。4.利用純化得到的重組serpins蛋白進行體外抑制實驗。rlvserpin3對枯草芽孢桿菌和鰻弧菌的結(jié)合活力很強,而對溶壁微球菌和大腸桿菌的結(jié)合活力較弱。而且,rlvserpin3蛋白能夠通過對枯草芽孢桿菌和溶壁微球菌所分泌的蛋白酶的有效抑制進而抑制它們的生長。rlvserpin7不僅表現(xiàn)出對枯草芽孢桿菌和鰻弧菌強的結(jié)合活力,而且對枯草芽孢桿菌分泌的蛋白酶有顯著的抑制作用。rlvserpin8蛋白對牛胰蛋白酶有顯著的抑制效果。rlvserpinb3蛋白對胰蛋白酶、彈性蛋白酶以及木瓜蛋白酶都有顯著的抑制效果。除此之外,rlvserpin3、rlvserpin7、rlvserpin8和rlvserpinb3蛋白能抑制酚氧化酶原反應(yīng)的激活。5.突變第373位氨基酸(p1位點)r為g后,rlvserpinb3對胰蛋白酶的抑制活性有顯著的降低;突變第374位氨基酸(p1’位點)i為g后,rlvserpinb3對胰蛋白酶的抑制活性有所下降,但與野生型相比抑制活性沒有顯著差異;而在同時突變373/374位氨基酸(p1p1’位點)ri為gg后,rlvserpinb3對胰蛋白酶的抑制活性顯著降低。gstpull-down檢測到rlvserpinb3蛋白能夠下拉與其擁有相同p1p1’激活位點的rlvsp1蛋白。這就表明serpin能夠通過識別具有相同p1p1’位點的蛋白酶而發(fā)揮抑制作用,改變p1p1’位點后,對蛋白酶的抑制效果不同,進一步表明serpin基因的p1位點對蛋白酶的抑制有選擇特異性。對rlvserpinb3與蛋白酶反應(yīng)物的westernblot檢測結(jié)果顯示,rlvserpinb3未與蛋白酶結(jié)合形成的大分子條帶,而是被降解形成小片段分子,而且隨著rlvserpinb3蛋白濃度的加大,小片段分子的濃度也相應(yīng)的增加。上述研究結(jié)果表明,不同serpin基因在對蝦機體中發(fā)揮的作用各不相同,或者是通過調(diào)節(jié)抗菌肽的產(chǎn)生,或者是通過對細菌蛋白酶以及參與酚氧化酶原系統(tǒng)激活的蛋白酶的抑制來參與到對蝦機體防御中。通過對候選基因serpin的免疫調(diào)控研究,并以此作為選育指標(biāo),將為凡納濱對蝦的抗病育種提供一定的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

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本文編號：1337377