本文關(guān)鍵詞：白藜蘆醇對人膠質(zhì)瘤及髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)組調(diào)節(jié)作用的初探

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【摘要】：背景及目的:人腦膠質(zhì)瘤及髓母細(xì)胞瘤是臨床上常見的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤,均具有較高的侵襲性及擴散性,目前臨床上尚無有效治療手段,即使采用手術(shù)結(jié)合放化療也會給患者預(yù)后造成很大影響。有研究表明,藥物治療是提高患者生存質(zhì)量的重要手段。白藜蘆醇是具有多種生物學(xué)功效的天然多酚類化合物,其抗腫瘤作用日趨受到重視,本課題旨在研究白藜蘆醇對腦腫瘤細(xì)胞系蛋白質(zhì)組的影響,探討白藜蘆醇可能的作用機制及細(xì)胞系敏感性差異原因,尋找可能存在的抗腫瘤作用靶點或腫瘤耐藥機制,為深入開展本領(lǐng)域研究、實現(xiàn)藥物臨床轉(zhuǎn)化及腫瘤個體化治療提供依據(jù)。實驗內(nèi)容主要包括(1)蛋白質(zhì)水平的影響:觀察對白藜蘆醇存在敏感性差異的不同腦腫瘤細(xì)胞系,在白藜蘆醇藥物處理前后,蛋白質(zhì)組的改變。(2)篩選及鑒定:選取若干藥物處理前后存在差異表達(dá)的蛋白,運用質(zhì)譜技術(shù)對其蛋白屬性加以鑒定。(3)差異蛋白質(zhì)驗證:采用免疫組化和RT-PCR等方法,對鑒定出的蛋白在白藜蘆醇處理前后細(xì)胞中的表達(dá)進行核實。(4)數(shù)據(jù)整理分析:繪制可能存在的調(diào)控腫瘤生長的生物網(wǎng)絡(luò)。方法:(1)篩選與藥物處理:選取兩種腦腫瘤細(xì)胞系(膠質(zhì)瘤及髓母細(xì)胞瘤),每種細(xì)胞系再分別選取對白藜蘆醇敏感性存在差異的細(xì)胞系(膠質(zhì)瘤敏感型:U251、欠敏感型:LN18及髓母細(xì)胞瘤敏感型:UW228-3、欠敏感型:DAOY)。細(xì)胞系u251、ln18及uw228-3培養(yǎng)于低糖dmem培養(yǎng)基(low-dulbecco’smodifiedeaglemedium,l-dmem)中,daoy培養(yǎng)于rpmi1640培養(yǎng)基(roswellparkmemorialinstitute1640,rpmi1640)中,各培養(yǎng)基中分別含有10%胎牛血清和1%抗生素(青霉素和鏈霉素),藥物處理組用100μm的白藜蘆醇(resveratrol,簡寫res)處理48h,收取細(xì)胞片用he染色觀察細(xì)胞形態(tài)。(2)蛋白雙向電泳分離及質(zhì)譜鑒定:收取細(xì)胞提取全蛋白進行雙向凝膠電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-de),蛋白質(zhì)酶切技術(shù)對變化差異點進行蛋白質(zhì)酶切,質(zhì)譜技術(shù)(massspectrometry,ms)對酶切樣品進行質(zhì)譜鑒定。(3)蛋白鑒定結(jié)果驗證:采用免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫印跡技術(shù)對發(fā)現(xiàn)的新的蛋白結(jié)果進行驗證,采用rt-pcr技術(shù)對調(diào)節(jié)新蛋白表達(dá)的基因進行基因水平的驗證。結(jié)果:(1)形態(tài)學(xué)改變:細(xì)胞系u251及uw228-3白藜蘆醇處理前后形態(tài)及數(shù)量上都有明顯的變化,均出現(xiàn)了神經(jīng)元樣變化且細(xì)胞數(shù)量減少,而細(xì)胞系ln18及daoy經(jīng)過白藜蘆醇處理前后,其形態(tài)和數(shù)量上幾乎沒有改變,提示:u251、uw228-3細(xì)胞系和ln18、daoy細(xì)胞系對白藜蘆醇存在明顯敏感性差異。(2)蛋白質(zhì)組學(xué)實驗:1)蛋白質(zhì)組整體影響:主要以上調(diào)為主,膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中,u251實驗組,正常組n檢出310個蛋白點,對照組res共檢出271個蛋白點,其中電腦軟件匹配結(jié)果共170個,上調(diào)比64.7%;在ln18細(xì)胞系中,正常組n檢出422個蛋白點,對照組res共檢出405個蛋白點,電腦軟件匹配共269個,上調(diào)比64.3%。髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中,daoy組中,正常組n共檢出298個點,對照組res共檢出342個點,軟件匹配234個,上調(diào)比42.7%;uw228-3組中,正常組n共檢出177個點,對照組res共檢出118個點,軟件配對69個,上調(diào)比49.3%。2)差異蛋白質(zhì)鑒定:蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果為烯醇化酶,磷酸甘油酸變位酶,角蛋白,膜聯(lián)蛋白,膜突蛋白,熱休克蛋白等。(3)差異蛋白質(zhì)的驗證:隨機選取幾個蛋白進行rt-pcr驗證,eno1、pdia1、akr1b1等均表現(xiàn)為用藥后表達(dá)水平下降,而兩種角蛋白在兩種敏感性細(xì)胞系中幾乎未檢測到表達(dá),在不敏感細(xì)胞系用藥后略有升高,cap1在daoy和u251中出現(xiàn)了上調(diào),cap1在uw228-3中下調(diào)明顯,在ln18中變化不明顯。(4)選取的表達(dá)共性的蛋白烯醇化酶eno1的wb實驗結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)(icc)實驗結(jié)果一致,均出現(xiàn)了藥物處理后下調(diào),與雙向電泳結(jié)果符合。結(jié)論:(1)初步得到了四種腦腫瘤細(xì)胞系白藜蘆醇處理前后蛋白質(zhì)表達(dá)譜,為更深入的研究提供參考。(2)無論是敏感或不敏感的四種細(xì)胞系,在白藜蘆醇藥物處理后,各自的蛋白質(zhì)組均有不同程度的改變。(3)藥物處理后,表達(dá)差異明顯的蛋白主要集中在能量代謝、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、腫瘤遷移和炎癥應(yīng)激反應(yīng)等方面,提示白藜蘆醇可能具有多種生物學(xué)功能。(4)表達(dá)發(fā)生變化的這些蛋白質(zhì)存在直接或間接地聯(lián)系,構(gòu)成一種生物網(wǎng)絡(luò),為下一步實驗研究指明了方向。
【關(guān)鍵詞】：白藜蘆醇 膠質(zhì)瘤 髓母細(xì)胞瘤 差異蛋白質(zhì)組學(xué) 雙向電泳 質(zhì)譜
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-29
• 實驗結(jié)果29-47
• 討論47-51
• 實驗結(jié)論及進一步研究設(shè)想51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 綜述56-69
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況69-70
• 致謝70-71

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本文編號：723353