發(fā)布時(shí)間：2017-08-09 13:31

  本文關(guān)鍵詞：肝郁脾虛證大鼠腸道鈉尿肽信號(hào)通路的變化及逍遙散的干預(yù)作用

  更多相關(guān)文章： 鈉尿肽 鈉尿肽受體 肝郁脾虛證 胃腸運(yùn)動(dòng) 逍遙散

【摘要】：目的:肝郁脾虛證是中醫(yī)肝郁和脾虛的復(fù)合證。為郁怒傷肝,肝失疏泄,氣機(jī)郁結(jié),肝郁則橫逆犯脾,脾失健運(yùn)而致。臨床觀察顯示肝郁脾虛證患者存在不同程度的胃腸運(yùn)動(dòng)障礙。研究表明肝郁脾虛證胃腸運(yùn)動(dòng)障礙與神經(jīng)遞質(zhì)、激素和細(xì)胞因子分泌異常密切相關(guān)。鈉尿肽(Natriuretic Peptides,NPs)是共存于神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的肽類激素,通過與細(xì)胞膜上的鈉尿肽受體(Natriuretic Peptide Receptors,NPRs)結(jié)合,發(fā)揮著利尿、排鈉、舒張血管、調(diào)節(jié)血壓等作用。眾多研究表明鈉尿肽及其相應(yīng)受體廣泛分布于胃腸道,并且可作為局部調(diào)質(zhì)以自分泌和旁分泌的方式對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)發(fā)揮抑制作用。NPs抑制胃腸平滑肌收縮活動(dòng)主要是通過NPs-NPRs-pGC-cGMP-PKG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的。然而,肝郁脾虛證引起的胃腸運(yùn)動(dòng)障礙的發(fā)生發(fā)展過程中NPs-NPRs-pGC-cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否起重要的作用,逍遙散改善肝郁脾虛證引起的胃腸運(yùn)動(dòng)障礙與NPs信號(hào)通路之間的關(guān)系尚不清楚。因此,本研究通過慢性溫和不可預(yù)知性刺激(Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)的方法制造肝郁脾虛證大鼠模型,并對(duì)大鼠施以不同劑量逍遙散、米氮平干預(yù)治療,在組織水平、分子水平上探討NPs-NPRs-pGC-cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑各關(guān)鍵環(huán)節(jié)在肝郁脾虛證大鼠空腸、結(jié)腸、直腸組織中的變化情況及逍遙散的干預(yù)機(jī)制。本研究共從以下四部分進(jìn)行探討:本部分通過慢性溫和不可預(yù)知性刺激結(jié)合孤養(yǎng)的方法制造肝郁脾虛證大鼠模型,并對(duì)大鼠施以不同劑量逍遙散、米氮平干預(yù)治療。將清潔級(jí)的健康雄性大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、逍遙散高、中、低劑量組、米氮平組,每組9只大鼠。除了正常組大鼠每籠三只飼養(yǎng)以外,其余組大鼠每籠一只孤養(yǎng)。正常組大鼠自由活動(dòng),不限制飲水飲食。用不同刺激因子交替持續(xù)刺激各治療組及模型組大鼠。逍遙散治療組和米氮平治療組大鼠分別在接受刺激一小時(shí)前用不同劑量逍遙散、米氮平水溶液灌胃處理。正常組與模型組大鼠用生理鹽水灌胃,造模實(shí)驗(yàn)持續(xù)四周,灌胃處理持續(xù)六周。逍遙散高、中、低劑量分別為30.6g/kg2d、15.3g/kg2d、7.65g/kg2d;米氮平劑量為10mg/kg2d。每周定期觀察各組大鼠一般狀態(tài)及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)表現(xiàn)、測(cè)量大鼠體重及尿d-木糖排泄率。結(jié)果:(1)大鼠的一般狀態(tài)觀察結(jié)果顯示造模結(jié)束時(shí)模型組大鼠神態(tài)倦怠、毛發(fā)枯黃散亂無光澤、胡須下垂、目色暗紅、吱吱細(xì)叫,扎堆或蟄伏在角落、大便多稀溏。(2)模型組大鼠體重增長(zhǎng)最為緩慢,米氮平組大鼠體重增長(zhǎng)最快。逍遙散劑量依賴性地改善大鼠體重增長(zhǎng)緩慢的情況。四周后,正常組、米氮平組及逍遙散高、中劑量組大鼠體重與模型組之間差異顯著(n=9,##p0.01)。(3)在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的穿格次數(shù)、站立次數(shù)、修飾次數(shù)三個(gè)行為學(xué)指標(biāo)中,模型組大鼠次數(shù)減少最多,米氮平組大鼠次數(shù)略有減少。逍遙散劑量依賴性地抑制曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中三個(gè)指標(biāo)次數(shù)減少的情況。四周后,正常組及各治療組與模型組大鼠之間差異顯著(n=9,##p0.01)。(4)尿d-木糖排泄率結(jié)果顯示模型組大鼠排泄率降低幅度最大,正常組大鼠排泄率基本不變。逍遙散劑量依賴性地改善尿d-木糖排泄率降低的情況。米氮平組大鼠排泄率略有降低。四周后,正常組及各治療組與模型組之間差異顯著(n=9,##p0.01)。第二部分:肝郁脾虛證大鼠腸道nps的表達(dá)變化及逍遙散、米氮平的干預(yù)作用方法:本部分利用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察心房鈉尿肽(atrialnatriureticpeptide,anp)、c型鈉尿肽(c-typenatriureticpeptide,cnp)在大鼠空腸、結(jié)腸、直腸組織中分布及表達(dá)情況;利用real-timepcr技術(shù)檢測(cè)anp、cnp的mrna表第一部分:肝郁脾虛證大鼠模型制備及逍遙散、米氮平的干預(yù)作用方法:達(dá)量差異。結(jié)果:(1)大鼠腹腔解剖所見胃腸情況顯示模型組大鼠腹腔內(nèi)有滲出液、胃腸極度擴(kuò)張、胃腸內(nèi)滯留大量?jī)?nèi)容物及氣體、伴有酸腐刺鼻氣味、尤其是盲腸部位尤為嚴(yán)重,腸道黏膜充血腫脹、血管突出、腸壁水腫變薄、腸道蠕動(dòng)非常差。正常組大鼠胃腸形態(tài)正常,腸黏膜呈粉紅色、腸壁無水腫粘連,內(nèi)容物較少,胃腸蠕動(dòng)正常。(2)利用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察到anp、cnp免疫陽(yáng)性細(xì)胞有棕黃色顆粒沉淀,主要分布于大鼠腸道的黏膜層和肌層。anp、cnp陽(yáng)性染色定位于平滑肌細(xì)胞,基底顆粒細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核及胞漿中。各組大鼠腸道肌層和黏膜層均表達(dá)anp、cnp,但各組之間表達(dá)量有差異。正常組及各治療組大鼠腸道anp、cnp的表達(dá)量低于模型組,且差異顯著(n=9;##p0.01);米氮平治療組與逍遙散高劑量組相比,anp、cnp的表達(dá)量并無顯著差異。逍遙散劑量依賴性地抑制anp、cnp的表達(dá)。anp在空腸的表達(dá)量最多,cnp在直腸的表達(dá)量最多。(3)利用real-timepcr檢測(cè)anp、cnp的mrna含量,結(jié)果顯示各組大鼠空腸、結(jié)腸、直腸均表達(dá)anp、cnp的mrna,但是表達(dá)量有差異。anp、cnp的mrna表達(dá)量趨勢(shì)與其免疫組織化學(xué)結(jié)果趨勢(shì)一致。第三部分:肝郁脾虛證大鼠腸道內(nèi)nprs表達(dá)變化及逍遙散、米氮平的干預(yù)作用方法:本部分利用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察鈉尿肽a型受體(natriureticpeptidereceptora,npr-a)、鈉尿肽b型受體(npr-b)、鈉尿肽c型受體(npr-c)在大鼠空腸、結(jié)腸、直腸組織中分布及表達(dá)情況;利用real-timepcr及westernblot檢測(cè)npr-a、npr-b、npr-c的mrna、蛋白表達(dá)量差異。結(jié)果:(1)利用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察到npr-a、npr-b、npr-c免疫陽(yáng)性細(xì)胞有棕黃色顆粒沉淀,主要表達(dá)于大鼠腸道各組織的黏膜層和肌層。npr-a、npr-b、npr-c陽(yáng)性染色定位于平滑肌細(xì)胞,基底顆粒細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上。各組大鼠空腸、結(jié)腸、直腸組織的肌層和黏膜層均表達(dá)npr-a、npr-b、npr-c,但各組之間表達(dá)量有差異。正常組、米氮平組、逍遙散高劑量組、逍遙散中劑量組npr-a、npr-b、npr-c的表達(dá)量低于模型組,且差異顯著(n=9;##p0.01);米氮平治療組與逍遙散高劑量組相比,npr-a、npr-b、npr-c的表達(dá)量并無顯著差異。逍遙散劑量依賴性地抑制npr-a、npr-b、npr-c的表達(dá)。npr-a、npr-c在空腸的表達(dá)量最多,npr-b在結(jié)腸的表達(dá)量最多。(2)利用real-timepcr檢測(cè)npr-a、npr-b、npr-c的mrna含量,結(jié)果顯示各組大鼠空腸、結(jié)腸、直腸均表達(dá)npr-a、npr-b、npr-c的mrna,但是各組表達(dá)量有差異。npr-a、npr-b、npr-c的mrna含量趨勢(shì)與其免疫組織化學(xué)結(jié)果趨勢(shì)一致。(3)westernblot結(jié)果顯示各組大鼠空腸、結(jié)腸、直腸均表達(dá)npr-a、npr-c蛋白,但是各組表達(dá)量有差異。npr-a、npr-c的蛋白表達(dá)趨勢(shì)與其免疫組織化學(xué)結(jié)果趨勢(shì)一致。第四部分:肝郁脾虛證大鼠胃腸激素及cgmp含量變化方法:本部分利用elisa(enzymelinkedimmunosorbentassay,酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定)檢測(cè)大鼠血清中胃泌素(gastrin,gas)、抑胃肽(gastricinhibitorypolypeptide,gip)含量的變化及大鼠血清及結(jié)腸組織勻漿液中cgmp含量變化。結(jié)果:(1)正常組及各治療組大鼠血清中胃泌素的含量均高于模型組,且差異顯著(n=9;##p0.01)。米氮平組與逍遙散高劑量組相比,胃泌素含量并無顯著差異。逍遙散劑量依賴性促進(jìn)胃泌素的合成分泌。(2)正常組及各治療組大鼠血清中抑胃肽的含量均低于模型組,且差異顯著(n=9;##p0.01)。米氮平組與逍遙散高劑量組相比,抑胃肽含量并無顯著差異。逍遙散劑量依賴性抑制抑胃肽的合成分泌。(3)正常組及各治療組大鼠血清中cgmp的含量均低于模型組,且差異顯著(n=9;##p0.01)。逍遙散高劑量組與中劑量組相比,cgmp的含量并無顯著差異。逍遙散劑量依賴性抑制cgmp生成。(4)正常組及各治療組大鼠結(jié)腸中cgmp的含量均低于模型組,且差異顯著(n=9;##p0.01)。逍遙散高劑量組與中劑量組、米氮平組相比,cgmp的含量并無顯著差異。逍遙散劑量依賴性抑制cgmp生成。結(jié)論:(1)ANP、CNP存在于大鼠腸道黏膜層的基底顆粒細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及肌層的平滑肌細(xì)胞的胞核及胞漿中。NPR-A、NPR-B、NPR-C存在于大鼠腸道黏膜層的基底顆粒細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及肌層的平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞膜上。(2)NPs-NPRs-pGC-cGMP信號(hào)通路上調(diào)可能是肝郁脾虛證大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)障礙的原因之一,米氮平及逍遙散劑量依賴性地下調(diào)該信號(hào)通路發(fā)揮治療效果,米氮平與高劑量治療效果相似,且逍遙散的高劑量為逍遙散各劑量中的最優(yōu)劑量。(3)肝郁脾虛證胃腸運(yùn)動(dòng)障礙可能與胃泌素、抑胃肽含量變化有關(guān)系,且逍遙散可能通過促進(jìn)胃泌素,抑制抑胃肽分泌而發(fā)揮治療作用。本研究首次證實(shí)了肝郁脾虛證大鼠腸道NPs-NPRs-pGC-cGMP信號(hào)通路上調(diào)的事實(shí),并闡明了疏肝健脾法典型方劑逍遙散對(duì)肝郁脾虛證胃腸運(yùn)動(dòng)障礙的干預(yù)機(jī)制。這項(xiàng)研究成果對(duì)研究肝郁脾虛證胃腸運(yùn)動(dòng)障礙的發(fā)病機(jī)制有重要的理論意義,并提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：鈉尿肽 鈉尿肽受體 肝郁脾虛證 胃腸運(yùn)動(dòng) 逍遙散
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R285.5
【目錄】：

• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 前言18-21
• 第一部分 肝郁脾虛證大鼠模型制備 及逍遙散、米氮平的干預(yù)作用21-28
• 材料和方法21-24
• 結(jié)果24-28
• 第二部分 肝郁脾虛證大鼠腸道 NPs 的表達(dá)變化 及逍遙散、米氮平的干預(yù)作用28-42
• 材料和方法28-32
• 結(jié)果32-42
• 第三部分 肝郁脾虛證大鼠腸道內(nèi)NPRs的表達(dá)變化 及逍遙散、米氮平的干預(yù)作用42-60
• 材料和方法42-44
• 結(jié)果44-60
• 第四部分 肝郁脾虛證大鼠胃腸激素 及 c GMP 含量變化60-67
• 材料和方法60-61
• 結(jié)果61-67
• 討論67-73
• 結(jié)論73-74
• 參考文獻(xiàn)74-79
• 綜述一79-99
• 參考文獻(xiàn)92-99
• 綜述二99-116
• 參考文獻(xiàn)113-116
• 附錄116-119
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況119-120
• 致謝120-121

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