本文關(guān)鍵詞：miRNA調(diào)控納米SiO_2誘導肺損傷靶基因作用的初步研究

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【摘要】：納米二氧化硅(Si02)廣泛應(yīng)用于幾乎涉及微米Si02的所有領(lǐng)域,由于微米級游離SiO2是一種高毒性顆粒,經(jīng)呼吸道吸入可引起矽肺和肺癌,與之有著相同化學組分的納米SiO2顆粒因其粒徑小(1-100nm),比表面積大,化學活性高,可能更易對機體尤其是肺臟造成損傷。國內(nèi)外的實驗研究表明納米Si02具有細胞毒性及致實驗大鼠出現(xiàn)肺組織損傷的作用,但其毒作用機制尚不清楚。隨著表觀遺傳學水平調(diào)控作用的發(fā)現(xiàn),微小RNA (miRNA)在細胞中廣泛的調(diào)控作用正逐漸引起人們重視。miRNA參與細胞增殖、分化、凋亡等多種生物進程,近期許多研究證實miRNAs與調(diào)控細胞分化、腫瘤發(fā)生、生物機體病毒防御有著極密切的關(guān)系。有研究結(jié)果顯示miRNA在肺損傷及纖維化進程中起調(diào)控作用。本課題組前期進行的實驗研究發(fā)現(xiàn),大鼠經(jīng)氣管一次性灌注納米SiO2、Illumina HiSeq 2000測序技術(shù)分析納米Si02致大鼠肺損傷miRNA表達譜變化的結(jié)果顯示,染塵7、15、30d時,染塵大鼠的肺組織病理損傷以炎癥為主,出現(xiàn)肺損傷差異表達上調(diào)的miRNA為miR-208；染塵60、90d時染塵大鼠的肺組織主要表現(xiàn)為肺間質(zhì)纖維化,差異表達上調(diào)的miRNA為miR-18a。miR-208與miR-18a調(diào)控其靶基因參與肺組織發(fā)生纖維化過程的作用有待進一步驗證。本研究使用納米Si02對NR8383大鼠肺泡巨噬細胞株染毒,染毒上清液共培養(yǎng)CHL中國倉鼠肺成纖維細胞,運用實時熒光定量PCR (RT-qPCR)方法分別檢測miR-208、miR-18a表達量；構(gòu)建miR-208模擬物／抑制物(mimics/inhibit)轉(zhuǎn)染NR8383細胞、miR-18a mimics/inhibit轉(zhuǎn)染CHL細胞,RT-qPCR、蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)技術(shù)分別檢測miR-208、miR-18a預(yù)測靶基因PDCD4mRNA、CTGF mRNA及蛋白表達,運用熒光素酶報告基因檢測miRNA與靶基因結(jié)合位點；對染毒的NR8383細胞上清液進行酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA法)檢測TGF-β1含量,在CHL細胞內(nèi)阻斷TGF-β1信號通路,檢測miR-18a表達量的改變,以此探明miR-208、miR-18a參與納米Si02誘導肺損傷過程中對靶基因表達的調(diào)控作用,為闡明納米二氧化硅毒性作用的分子機制提供可靠理論依據(jù)。實驗結(jié)果如下：1.運用MTT法測得納米Si02對NR8383細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.638 mg/ml,95%可信區(qū)間為0.117-1.576 mg/ml.光鏡下觀察到40μg/ml納米Si02染毒NR8383細胞24h后,貼壁生長的細胞數(shù)減少,細胞呈不規(guī)則形,大量粉塵粒子粘附在細胞壁上,細胞周圍呈現(xiàn)無粒子圓暈狀區(qū)域,部分細胞膨大并開始崩解,死亡細胞數(shù)目增多,培養(yǎng)基中可見死亡細胞碎片。40μg/ml納米Si()2染毒NR8383細胞24h后,與空白對照組相比,納米SiO2組miR-208表達量極低,未檢測到循環(huán)閾值(CT值)。運用Targetscan.org對miR-208與PDCD4進行結(jié)合位點預(yù)測,保守的目標概率(Probability of Conserved Targeting, PCT)為0.59,提示PDCD4可能是miR-208調(diào)控的靶基因。]miR-208 mimics/inhibit轉(zhuǎn)染NR8383細胞48h后,光鏡、熒光顯微鏡下觀察到NR8383細胞形態(tài)未見明顯改變,轉(zhuǎn)染率為85%。miR-208mimics/inhibit轉(zhuǎn)染NR8383細胞48h后,與空白對照組相比,miR-208 mimics組、mimics NC組細胞增殖率分別為(100.43±15.54)%、(98.29±2.06)%,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05); miR-208 inhibit組、inhibitNC組細胞增殖率分別為(103.58±10.74)%、(109.74±10.06)%.差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。miR-208mimics轉(zhuǎn)染NR8383細胞48h后,與空白對照組相比,miR-208 mimics組、mimics NC組miR-208相對表達水平為152.32±0.4O、0.92±0.08,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01). miR-208 mimics/inhibit轉(zhuǎn)染NR8383細胞48h后,與空白對照組相比測得,miR-208 mimics組、mimics NC組PDCD4 mRNA相對表達水平分別為6.00±0.04、0.35±±0.00,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05), miR-208 inhibit組、inhibit NC組PDCD4 mRNA相對表達水平分別為0.14±0.06、1.40±0.22,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05); miR-208 mimics組、mimics NC組PDCD4蛋白灰度值比值為10.68±0.33、5.11±0.10,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01), miR-208 inhibit組、inhibit NC組PDCD4蛋白灰度值比值為1.24±0.14、1.67±0013,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)果提示40μg/ml納米SiO2染毒NR8383細胞并未引起細胞內(nèi)miR-208表達水平的改變,過表達miR-208可導致PDCD4 mRNA、蛋白表達上調(diào),抑制miR-208可致PDCD4 mRNA下調(diào),蛋白表達水平差異不明顯。miR-208有可能正調(diào)控或者間接調(diào)控靶基因PDCD4表達。2.0(陰性對照組)、10、20、40μg/ml納米SiO2染毒NR8383細胞24h后,培養(yǎng)上清液與CHL細胞共培養(yǎng)24h, MTT法測得CHL細胞增殖率分別為(100.00±0.03)%、(107.43±2.58)%、(106.50±2.92)%、(112.07±2.13)%,40μg/ml納米SiO2染毒組CHL細胞增殖率高于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),10、20μg/ml納米SiO2染毒組與陰性對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。40μg/ml納米SiO2染毒NR8383細胞上清液刺激CHL細胞24h后,以空白組為對照,miR-18a相對表達量為1.34±0.08,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Targetscan.org預(yù)測miR-18a與CTGF結(jié)合位點結(jié)果Pcr值為0.45,提示CTGF可能是miR-18a所調(diào)控的靶基因。miR-18a mimics/inhibit轉(zhuǎn)染CHL細胞48h后,光鏡、熒光顯微鏡下觀察到CHL細胞形態(tài)未見明顯改變,轉(zhuǎn)染率為90%。 miR-18a mimics/inhibit轉(zhuǎn)染CHL細胞48h后,與空白對照組相比,miR-18a mimics組、mimics NC組細胞增殖率分別為(94.20±10.82)%、(103.28±10.84)%,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；miR-18a inhibit組、inhibit NC組細胞增殖率分別為(98.79±7.57)%、(97.58±10.79)%,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。miR-18a mimics轉(zhuǎn)染CHL細胞48h后,與空白對照組相比,miR-18a mimics組、mimics NC組miR-18a相對表達水平為247.45±0.07、1.09±0.08,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。miR-18a mimics/inhibit轉(zhuǎn)染CHL細胞48h后,與空白對照組相比,miR-18a mimics組、mimics NC組CTGF mRNA相對表達水平分別為0.74±0.08、0.96±0.08,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05), miR-18a inhibit組、inhibit NC組CTGF mRNA相對表達水平分別為2.67±0.41、0.46±0.01,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05); miR-18a mimics組、mimics NC組CTGF蛋白灰度值比值分別為0.61±0.07、1.01±0.09,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01), miR-18a inhibit組、inhibit NC組CTGF蛋白灰度值比值分別為3.67±0.09、0.90±0.03,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01). miR-18a與CTGF結(jié)合位點的雙熒光素酶報告基因分析結(jié)果顯示,以mimics NC組為對照,miR-18a mimics對CTGF野生型的報告相對熒光值為0.50±0.02,突變型的報告相對熒光值為0.86±0.04,miR-18a對CTGF有較明顯的下調(diào)作用,結(jié)果提示,miR-18a可通過CTGF3'UTR區(qū)的該位點調(diào)控基因的表達。10,20,40μg/ml納米SiO2染毒NR8383細胞24h后,經(jīng)ELISA法檢測,細胞上清液中TGF-β1含量分別為642.0±2.5、810.0±3.6、1096.0±2.6 pg/ml,與陰性對照組920.0±5.1 pg/ml相比,40μg/ml組TGF-β1表達量增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05); 10、20μg/ml組TGF-β1表達量減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。分別給予CHL細胞5ng/ml TGF-β1、4nmol/ml TGF-β1受體阻斷劑+5ng/ml TGF-β1培養(yǎng)24h后,以空白組為對照,TGF-β1組、TGF-β1+受體阻斷劑組miR-18a相對表達水平分別為0.64±0.19、3.46±0.18,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05); TGF-β1組、TGF-β1+受體阻斷劑組CTGF mRNA相對表達水平分別為5.49±0.81、0.28±0.07,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05); TGF-β1組、TGF-β1+受體阻斷劑組CTGF蛋白相對表達量分別為1.15±0.18、0.62±0.01,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)果提示CTGF是miR-18a調(diào)控的靶基因,miR-18a參與TGF-β1信號通路,通過靶基因CTGF的3'UTR位點負調(diào)控CTGF的表達。綜上,40μg/ml納米SiO2染毒NR8383細胞未引起細胞內(nèi)miR-208表達水平的改變,過表達miR-208可導致PDCD4 mRNA、蛋白表達上調(diào),抑制miR-208可致PDCD4 mRNA下調(diào),蛋白表達水平差異不明顯,miR-208有可能正調(diào)控或者間接調(diào)控靶基因PDCD4表達：40μg/ml納米SiO2染毒NR8383細胞上清液刺激CHL細胞增殖且miR-18a表達量增加,CTGF是miR-18a調(diào)控靶基因,miR-18a參與TGF-β1信號通路,通過與靶基因CTGF的3'UTR位點結(jié)合,負調(diào)控CTGF的表達,進而可能對肺纖維化的發(fā)生發(fā)展進程起調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：納米SiO_2 肺損傷 miR-208 miR-18a 靶基因 PDCD4 CTGF TGF-β1信號通路
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 主要縮略詞表9-11
• 前言11-13
• 第一章 miR-208調(diào)控納米SiO_2誘導肺損傷靶基因PDCD4作用的研究13-32
• 第一節(jié) 納米SiO_2對NR8383細胞表達miR-208的影響13-21
• 1 材料與方法13-16
• 2 結(jié)果16-19
• 3 討論19-20
• 4 小結(jié)20-21
• 第二節(jié) 過表達和低表達miR-208對靶基因PDCD4的調(diào)控作用21-32
• 1 材料與方法21-25
• 2 結(jié)果25-30
• 3 討論30-31
• 4 小結(jié)31-32
• 第二章 miR-18a調(diào)控納米SiO_2誘導肺損傷靶基因CTGF作用的研究32-51
• 第一節(jié) 納米SiO_2染毒NR8383細胞上清液對CHL細胞表達miR-18a的影響32-36
• 1 材料與方法32-33
• 2 結(jié)果33-35
• 3 討論35
• 4 小結(jié)35-36
• 第二節(jié) 過表達和低表達miR-18a對靶基因CTGF的調(diào)控作用36-45
• 1 材料與方法36-38
• 2 結(jié)果38-44
• 3 討論44
• 4 小結(jié)44-45
• 第三節(jié) miR-18a通過TGF-β1信號通路對CTGF的調(diào)控作用45-51
• 1 材料與方法45-46
• 2 結(jié)果46-49
• 3 討論49-50
• 4 小結(jié)50-51
• 第三章 總結(jié)與展望51-52
• 1 研究工作總結(jié)51
• 2 特色與創(chuàng)新51
• 3 進一步工作需要解決的問題51-52
• 參考文獻52-57
• 綜述57-63
• 綜述參考文獻61-63
• 作者簡介63-64
• 攻讀碩士期間發(fā)表文章64-65
• 致謝65

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