本文關鍵詞：可再生附屬器官的基因活性皮膚再生材料構建及性能研究

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【摘要】：皮膚附屬器官的再生是皮膚組織修復與再生功能化的重要標志之一。盡管目前商業(yè)化的人工皮膚替代物能夠實現表皮和真皮的結構性修復,但皮膚附屬器官仍然缺失。為了在表皮和真皮組織修復的同時實現毛囊再生,以基因工程方法,將目的基因導入質粒,制備肝細胞生長因子質粒DNA (HGF-pDNA),實現對目的蛋白HGF的持續(xù)表達。以骨髓間充質干細胞(BMSCs)為種子細胞,制備負載BMSCs的基因活性膠原-殼聚糖支架材料(GASM)。將脂質體(LipofectamineTM 2000)與pDNA利用靜電作用形成納米粒子來保護pDNA,將納米粒子導入膠原-殼聚糖支架,得到基因活性支架(GAS),激光共聚焦顯微鏡(CLSM)及掃描電子顯微鏡(SEM)顯示納米粒子能夠均勻分散在支架中,并良好粘附在孔壁表面。將BMSCs種植到支架中,Western Blotting結果顯示,相對于空白支架,GAS能夠極大促進目的蛋白HGF的表達。利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)及Western Blotting對基因活性支架中毛囊特征因子多功能蛋白聚糖(Versican)、堿性磷酸酶(ALP)、Ⅳ型膠原(COL IV)分析顯示,三種信號因子在基因和蛋白水平的表達都較空白支架高,表明BMSCs被GAS誘導向毛囊定向分化。以負載BMSC的空白支架(BSM)和HGF-pDNA GAS為對照組,將實驗組GASM植入SD大鼠的背部全層皮膚損傷模型中。大體觀察結果發(fā)現,實驗組能夠在再生表皮與真皮組織的同時,實現毛發(fā)的再生。對10 d、21 d和35 d的組織切片HE染色分析發(fā)現,在10 d時可見松散的團狀類毛囊結構,而21d和35 d時這種結構逐漸成熟。為鑒定再生類毛囊結構,對再生組織進行免疫組化(IHC)分析發(fā)現,再生類毛囊結構呈現Versican、ALP和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)陽性,表明再生類毛囊結構具有毛囊特征。對其進行RT-qPCR及Western Blotting分析顯示,相對于對照組,實驗組10 d時在Versican、ALP和α-SMA因子蛋白及基因水平的表達都較高。將雄性大鼠的BMSCs作為種子細胞植入雌性體內,采用Y染色體原位雜交的方法鑒定再生毛囊結構細胞來源,發(fā)現在10 d時部分細胞呈現Y染色體陽性,而在21 d時陽性細胞比例急劇下降,表明植入的外源性BMSCs與自體細胞共同參與再生組織毛囊結構的重建。為了實現原位誘導再生,在不加入BMSCs的GAS中引入SDF-1,以期其能夠誘導自體干細胞參與毛囊再生。我們將合成的磺化殼聚糖(OCS)與聚賴氨酸(PLL)和基質細胞衍生因子-1(SDF-1)結合成復合粒子,酶聯免疫吸附測定試劑盒(ELISA)測定結果顯示復合粒子對生長因子的負載率達到63.01%,在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中,168 h時對SDF-1的釋放比率約為40%,有效實現對SDF-1的控制釋放。體內實驗結果顯示35 d時,負載SDF-1的基因活性支架能夠再生出類毛囊囊狀結構,而不含SDF-1復合粒子的基因活性支架則不能再生類毛囊囊狀結構。
【關鍵詞】：HGF SDF-1 基因活性 人工皮膚替代物 附屬器官
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 1 引言13-31
• 1.1 組織工程與再生醫(yī)學13-19
• 1.1.1 組織工程與再生醫(yī)學概述13
• 1.1.2 組織工程與再生醫(yī)學支架材料設計13-15
• 1.1.3 組織工程與再生醫(yī)學支架材料的選擇15-16
• 1.1.4 組織工程與再生醫(yī)學支架的形式16-18
• 1.1.5 支架材料的生物活性化18-19
• 1.2 皮膚再生與皮膚替代物19-23
• 1.2.1 皮膚修復的生理過程19-20
• 1.2.2 人工皮膚替代物的需求與發(fā)展20-22
• 1.2.3 人工皮膚替代物的主要問題22-23
• 1.3 皮膚附屬器官再生意義23-27
• 1.3.1 皮膚附屬器官發(fā)育的生理過程24-25
• 1.3.2 皮膚附屬器官再生種子細胞25-26
• 1.3.3 皮膚附屬器官再生因子26-27
• 1.3.4 皮膚附屬器官再生材料體系27
• 1.4 基因工程27-29
• 1.4.1 基因工程概述27-28
• 1.4.2 基因傳遞體系28
• 1.4.3 基因活性支架材料28-29
• 1.5 課題提出29-31
• 2 基因活性支架的制備及其體外性能評價31-45
• 2.1 實驗部分31-38
• 2.1.1 主要原料與試劑31-33
• 2.1.2 膠原的提取33
• 2.1.3 大鼠骨髓間充質干細胞的提取及培養(yǎng)33-34
• 2.1.4 膠原結構表征34
• 2.1.5 膠原-殼聚糖支架制備34
• 2.1.6 HGF-pDNA/liposome復合納米粒子制備34
• 2.1.7 復合粒子形貌表征34
• 2.1.8 復合粒子粒徑分析34-35
• 2.1.9 GAS制備35
• 2.1.10 復合粒子在支架中分布35
• 2.1.11 GASM制備35
• 2.1.12 GAS表面形貌分析35
• 2.1.13 體外HGF的表達35-37
• 2.1.14 GAS體外誘導BMSCs分化性能研究37-38
• 2.2 提取膠原表征38-39
• 2.3 HGF-pDNA/liposome復合粒子表征39
• 2.4 GAS的表面形貌39-40
• 2.5 GAS細胞相容性40-41
• 2.6 GAS中細胞對目的蛋白的表達41-42
• 2.7 GAS誘導BMSCs毛囊定向分化42-44
• 2.8 本章小結44-45
• 3 基因活性支架誘導毛囊再生的體內評價實驗45-61
• 3.1 實驗部分46-49
• 3.1.1 主要原料與試劑46
• 3.1.2 動物實驗模型46-47
• 3.1.3 毛囊再生效果的大體觀察與統(tǒng)計結果分析47
• 3.1.4 組織學觀察47
• 3.1.5 毛囊結構鑒定47-48
• 3.1.6 再生毛囊來源的鑒定48-49
• 3.1.7 皮脂腺的鑒定49
• 3.2 動物實驗模型49-50
• 3.3 傷口修復過程的觀察50-51
• 3.4 傷口修復效果的觀察51-52
• 3.5 再生毛囊結構細胞來源的鑒定52-54
• 3.6 再生組織中誘導因子HGF基因及蛋白水平的表達54
• 3.7 毛囊結構的H&E染色54-56
• 3.8 類皮脂腺結構的鑒定56
• 3.9 再生毛囊結構的免疫組化分析56-57
• 3.10 再生組織相關因子基因蛋白水平的表達57-59
• 3.11 本章小結59-61
• 4 復合募集因子的基因活性支架誘導毛囊再生體系61-73
• 4.1 實驗部分62-64
• 4.1.1 主要原料與試劑62
• 4.1.2 磺化殼聚糖的制備62
• 4.1.3 磺化殼聚糖結構表征62-63
• 4.1.4 OCS/PLL/SDF-1復合納米粒子的制備63
• 4.1.5 OCS/PLL/SDF-1復合納米粒子粒徑與電位63
• 4.1.6 負載SDF-1復合粒子的支架的制備63
• 4.1.7 SDF-1體外釋放行為63
• 4.1.8 SDF-1包封率的測定63
• 4.1.9 SDF-1活性的保護63-64
• 4.1.10 動物實驗模型64
• 4.1.11 附屬器官再生效果分析64
• 4.2 磺化殼聚糖的結構表征64-65
• 4.3 OCS/PLL/SDF-1復合粒子的粒徑和表面電位65
• 4.4 OCS/PLL/SDF-1復合粒子對SDF-1包封率65-66
• 4.5 OCS/PLL/SDF-1復合粒子對SDF-1釋放66-67
• 4.6 OCS/PLL/SDF-1復合粒子對SDF-1保護性能67-68
• 4.7 OCS/PLL/SDF-1復合粒子對BMSCs的誘導遷移性能68-69
• 4.8 OCS/PLL/SDF-1的細胞毒性69-70
• 4.9 動物實驗模型70-71
• 4.10 原位誘導毛囊再生性能71-72
• 4.11 本章小結72-73
• 全文總結73-75
• 參考文獻75-87
• 作者簡介87

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