本文關(guān)鍵詞：可再生附屬器官的基因活性皮膚再生材料構(gòu)建及性能研究

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【摘要】：皮膚附屬器官的再生是皮膚組織修復(fù)與再生功能化的重要標(biāo)志之一。盡管目前商業(yè)化的人工皮膚替代物能夠?qū)崿F(xiàn)表皮和真皮的結(jié)構(gòu)性修復(fù),但皮膚附屬器官仍然缺失。為了在表皮和真皮組織修復(fù)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)毛囊再生,以基因工程方法,將目的基因?qū)胭|(zhì)粒,制備肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子質(zhì)粒DNA (HGF-pDNA),實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白HGF的持續(xù)表達(dá)。以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)為種子細(xì)胞,制備負(fù)載BMSCs的基因活性膠原-殼聚糖支架材料(GASM)。將脂質(zhì)體(LipofectamineTM 2000)與pDNA利用靜電作用形成納米粒子來保護(hù)pDNA,將納米粒子導(dǎo)入膠原-殼聚糖支架,得到基因活性支架(GAS),激光共聚焦顯微鏡(CLSM)及掃描電子顯微鏡(SEM)顯示納米粒子能夠均勻分散在支架中,并良好粘附在孔壁表面。將BMSCs種植到支架中,Western Blotting結(jié)果顯示,相對(duì)于空白支架,GAS能夠極大促進(jìn)目的蛋白HGF的表達(dá)。利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)及Western Blotting對(duì)基因活性支架中毛囊特征因子多功能蛋白聚糖(Versican)、堿性磷酸酶(ALP)、Ⅳ型膠原(COL IV)分析顯示,三種信號(hào)因子在基因和蛋白水平的表達(dá)都較空白支架高,表明BMSCs被GAS誘導(dǎo)向毛囊定向分化。以負(fù)載BMSC的空白支架(BSM)和HGF-pDNA GAS為對(duì)照組,將實(shí)驗(yàn)組GASM植入SD大鼠的背部全層皮膚損傷模型中。大體觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組能夠在再生表皮與真皮組織的同時(shí),實(shí)現(xiàn)毛發(fā)的再生。對(duì)10 d、21 d和35 d的組織切片HE染色分析發(fā)現(xiàn),在10 d時(shí)可見松散的團(tuán)狀類毛囊結(jié)構(gòu),而21d和35 d時(shí)這種結(jié)構(gòu)逐漸成熟。為鑒定再生類毛囊結(jié)構(gòu),對(duì)再生組織進(jìn)行免疫組化(IHC)分析發(fā)現(xiàn),再生類毛囊結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)Versican、ALP和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)陽(yáng)性,表明再生類毛囊結(jié)構(gòu)具有毛囊特征。對(duì)其進(jìn)行RT-qPCR及Western Blotting分析顯示,相對(duì)于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組10 d時(shí)在Versican、ALP和α-SMA因子蛋白及基因水平的表達(dá)都較高。將雄性大鼠的BMSCs作為種子細(xì)胞植入雌性體內(nèi),采用Y染色體原位雜交的方法鑒定再生毛囊結(jié)構(gòu)細(xì)胞來源,發(fā)現(xiàn)在10 d時(shí)部分細(xì)胞呈現(xiàn)Y染色體陽(yáng)性,而在21 d時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞比例急劇下降,表明植入的外源性BMSCs與自體細(xì)胞共同參與再生組織毛囊結(jié)構(gòu)的重建。為了實(shí)現(xiàn)原位誘導(dǎo)再生,在不加入BMSCs的GAS中引入SDF-1,以期其能夠誘導(dǎo)自體干細(xì)胞參與毛囊再生。我們將合成的磺化殼聚糖(OCS)與聚賴氨酸(PLL)和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)結(jié)合成復(fù)合粒子,酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(ELISA)測(cè)定結(jié)果顯示復(fù)合粒子對(duì)生長(zhǎng)因子的負(fù)載率達(dá)到63.01%,在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中,168 h時(shí)對(duì)SDF-1的釋放比率約為40%,有效實(shí)現(xiàn)對(duì)SDF-1的控制釋放。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示35 d時(shí),負(fù)載SDF-1的基因活性支架能夠再生出類毛囊囊狀結(jié)構(gòu),而不含SDF-1復(fù)合粒子的基因活性支架則不能再生類毛囊囊狀結(jié)構(gòu)。
【關(guān)鍵詞】：HGF SDF-1 基因活性 人工皮膚替代物 附屬器官
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 1 引言13-31
• 1.1 組織工程與再生醫(yī)學(xué)13-19
• 1.1.1 組織工程與再生醫(yī)學(xué)概述13
• 1.1.2 組織工程與再生醫(yī)學(xué)支架材料設(shè)計(jì)13-15
• 1.1.3 組織工程與再生醫(yī)學(xué)支架材料的選擇15-16
• 1.1.4 組織工程與再生醫(yī)學(xué)支架的形式16-18
• 1.1.5 支架材料的生物活性化18-19
• 1.2 皮膚再生與皮膚替代物19-23
• 1.2.1 皮膚修復(fù)的生理過程19-20
• 1.2.2 人工皮膚替代物的需求與發(fā)展20-22
• 1.2.3 人工皮膚替代物的主要問題22-23
• 1.3 皮膚附屬器官再生意義23-27
• 1.3.1 皮膚附屬器官發(fā)育的生理過程24-25
• 1.3.2 皮膚附屬器官再生種子細(xì)胞25-26
• 1.3.3 皮膚附屬器官再生因子26-27
• 1.3.4 皮膚附屬器官再生材料體系27
• 1.4 基因工程27-29
• 1.4.1 基因工程概述27-28
• 1.4.2 基因傳遞體系28
• 1.4.3 基因活性支架材料28-29
• 1.5 課題提出29-31
• 2 基因活性支架的制備及其體外性能評(píng)價(jià)31-45
• 2.1 實(shí)驗(yàn)部分31-38
• 2.1.1 主要原料與試劑31-33
• 2.1.2 膠原的提取33
• 2.1.3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取及培養(yǎng)33-34
• 2.1.4 膠原結(jié)構(gòu)表征34
• 2.1.5 膠原-殼聚糖支架制備34
• 2.1.6 HGF-pDNA/liposome復(fù)合納米粒子制備34
• 2.1.7 復(fù)合粒子形貌表征34
• 2.1.8 復(fù)合粒子粒徑分析34-35
• 2.1.9 GAS制備35
• 2.1.10 復(fù)合粒子在支架中分布35
• 2.1.11 GASM制備35
• 2.1.12 GAS表面形貌分析35
• 2.1.13 體外HGF的表達(dá)35-37
• 2.1.14 GAS體外誘導(dǎo)BMSCs分化性能研究37-38
• 2.2 提取膠原表征38-39
• 2.3 HGF-pDNA/liposome復(fù)合粒子表征39
• 2.4 GAS的表面形貌39-40
• 2.5 GAS細(xì)胞相容性40-41
• 2.6 GAS中細(xì)胞對(duì)目的蛋白的表達(dá)41-42
• 2.7 GAS誘導(dǎo)BMSCs毛囊定向分化42-44
• 2.8 本章小結(jié)44-45
• 3 基因活性支架誘導(dǎo)毛囊再生的體內(nèi)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)45-61
• 3.1 實(shí)驗(yàn)部分46-49
• 3.1.1 主要原料與試劑46
• 3.1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/span>46-47
• 3.1.3 毛囊再生效果的大體觀察與統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析47
• 3.1.4 組織學(xué)觀察47
• 3.1.5 毛囊結(jié)構(gòu)鑒定47-48
• 3.1.6 再生毛囊來源的鑒定48-49
• 3.1.7 皮脂腺的鑒定49
• 3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/span>49-50
• 3.3 傷口修復(fù)過程的觀察50-51
• 3.4 傷口修復(fù)效果的觀察51-52
• 3.5 再生毛囊結(jié)構(gòu)細(xì)胞來源的鑒定52-54
• 3.6 再生組織中誘導(dǎo)因子HGF基因及蛋白水平的表達(dá)54
• 3.7 毛囊結(jié)構(gòu)的H&E染色54-56
• 3.8 類皮脂腺結(jié)構(gòu)的鑒定56
• 3.9 再生毛囊結(jié)構(gòu)的免疫組化分析56-57
• 3.10 再生組織相關(guān)因子基因蛋白水平的表達(dá)57-59
• 3.11 本章小結(jié)59-61
• 4 復(fù)合募集因子的基因活性支架誘導(dǎo)毛囊再生體系61-73
• 4.1 實(shí)驗(yàn)部分62-64
• 4.1.1 主要原料與試劑62
• 4.1.2 磺化殼聚糖的制備62
• 4.1.3 磺化殼聚糖結(jié)構(gòu)表征62-63
• 4.1.4 OCS/PLL/SDF-1復(fù)合納米粒子的制備63
• 4.1.5 OCS/PLL/SDF-1復(fù)合納米粒子粒徑與電位63
• 4.1.6 負(fù)載SDF-1復(fù)合粒子的支架的制備63
• 4.1.7 SDF-1體外釋放行為63
• 4.1.8 SDF-1包封率的測(cè)定63
• 4.1.9 SDF-1活性的保護(hù)63-64
• 4.1.10 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/span>64
• 4.1.11 附屬器官再生效果分析64
• 4.2 磺化殼聚糖的結(jié)構(gòu)表征64-65
• 4.3 OCS/PLL/SDF-1復(fù)合粒子的粒徑和表面電位65
• 4.4 OCS/PLL/SDF-1復(fù)合粒子對(duì)SDF-1包封率65-66
• 4.5 OCS/PLL/SDF-1復(fù)合粒子對(duì)SDF-1釋放66-67
• 4.6 OCS/PLL/SDF-1復(fù)合粒子對(duì)SDF-1保護(hù)性能67-68
• 4.7 OCS/PLL/SDF-1復(fù)合粒子對(duì)BMSCs的誘導(dǎo)遷移性能68-69
• 4.8 OCS/PLL/SDF-1的細(xì)胞毒性69-70
• 4.9 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/span>70-71
• 4.10 原位誘導(dǎo)毛囊再生性能71-72
• 4.11 本章小結(jié)72-73
• 全文總結(jié)73-75
• 參考文獻(xiàn)75-87
• 作者簡(jiǎn)介87

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