本文關(guān)鍵詞：弓形蟲(chóng)SAG2、GRA6、GRA7基因的重組表達(dá)及應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的 弓形蟲(chóng)(Toxopasma gondii)是嚴(yán)重影響健康的機(jī)會(huì)致病原蟲(chóng)。能在人類與家畜之間傳播,呈世界性分布。它可侵犯除健康成熟紅細(xì)胞以外的有核細(xì)胞,引起多器官組織的病變。對(duì)于正常人群,機(jī)體免疫力正常,則感染弓形蟲(chóng)后常為無(wú)癥狀帶蟲(chóng)狀態(tài),然而對(duì)于特殊人群如當(dāng)患有艾滋病、結(jié)核、腫瘤、器官移植后等免疫功能受損或抑制時(shí),弓形蟲(chóng)就機(jī)會(huì)性感染引起明顯的臨床癥狀,甚至死亡。若孕婦患有弓形蟲(chóng)感染可引起胎兒畸形及流產(chǎn),嚴(yán)重者可出現(xiàn)死胎。在家禽之間的傳播導(dǎo)致大量家禽的死亡,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因而預(yù)防弓形蟲(chóng)病的發(fā)生,早期診斷弓形蟲(chóng)病具有很大的臨床價(jià)值。然而弓形蟲(chóng)寄生于宿主細(xì)胞內(nèi),直接取弓形蟲(chóng)病原體困難,而臨床表現(xiàn)無(wú)特異性,單靠臨床診斷非常困難。目前常用的方法有病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué),每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。病原體直接鏡檢是傳統(tǒng)方法,特異性高但容易漏診,不能適應(yīng)臨床需要。免疫學(xué)診斷方法敏感性及特異性高,操作相對(duì)便捷,所以應(yīng)用免疫學(xué)方法診斷弓形蟲(chóng)病更為重要。隨著近幾年分子生物學(xué)的發(fā)展,將有診斷價(jià)值的弓形蟲(chóng)抗原分子克隆到原核或真核表達(dá)載體,進(jìn)行表達(dá)、純化,從而獲得高純度抗原,特異性高,應(yīng)用廣泛。SAG2是表面抗原蛋白,GRA6、GRA7是致密顆粒蛋白,具有較強(qiáng)的抗原性和免疫原性。本研究首先構(gòu)建了弓形蟲(chóng)的RH株SAG2、GRA6和GRA7基因的重組質(zhì)粒pGEX-4T-SAG2、 pGEX-4T-GRA6和pGEX-4T-GRA7,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21,然后用IPTG體外誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白,純化的蛋白作為包被抗原,對(duì)358份人源血清進(jìn)行ELISA檢測(cè),為SAG2、GRA6和GRA7作為人、獸弓形蟲(chóng)病診斷抗原的研究奠定基礎(chǔ)。方法1.目的基因的擴(kuò)增 從弓形蟲(chóng)感染的小鼠腹水中提取RH株的基因組DNA,然后以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定純化回收。 2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物及載體pGEX-4T分別進(jìn)行雙酶切(EcoRI、BamHI),通過(guò)回收試劑盒回收酶切片段,將獲取的目的片段與載體進(jìn)行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞。酶切鑒定后送基因公司測(cè)序。3.重組質(zhì)粒的表達(dá)和純化IPTG體外誘導(dǎo)表達(dá),利用His-bindTM柱柱純化融合蛋白,SDS-PAGE I口免疫印跡分析。結(jié)果1.PCR特異地?cái)U(kuò)增出目的基因,SAG2、GRA6和GRA7擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定,大小分別為561、693和714bp,長(zhǎng)度與理論值相符。2.重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI、BamHl雙酶切,電泳顯示在相應(yīng)位置出現(xiàn)條帶,與預(yù)期大小(561、693和714bp)一致。對(duì)酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行送樣測(cè)序,測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)后與原始序列同源性100%,表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒。3.采取各組份樣品,進(jìn)行SDS-PAGE分析,電泳顯示在相應(yīng)位置(47KD、52KD、53KD)出現(xiàn)明顯條帶,表明融合蛋白SAG2、GRA6和GRA7成功得到了表達(dá),表達(dá)主要方式為包涵體表達(dá)。4.融合蛋白經(jīng)過(guò)免疫印跡分析,在相應(yīng)位置(47D、52KD、53KD)出現(xiàn)明顯條帶,表明融合蛋白SAG2、GRA6和GRA7表達(dá)正確。5.利用純化的蛋白作為包被抗原,對(duì)人源358份血清的弓形蟲(chóng)IgG抗體檢測(cè),陽(yáng)性率為3.07%-4.75%。進(jìn)口的弓形蟲(chóng)診斷試劑盒對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性的樣本復(fù)檢符合率為100%,48份陰性血清進(jìn)行平行檢測(cè),結(jié)果均為陰性,與ELISA結(jié)果相符。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲(chóng) 融合蛋白表達(dá) 蛋白純化 ELISA檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R382.5
【目錄】：

• 研究生導(dǎo)師簡(jiǎn)介4
• 課題指導(dǎo)小組簡(jiǎn)介4-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 主要符號(hào)表11-12
• 引言12-16
• 1 弓形蟲(chóng)及弓形蟲(chóng)病概況12-13
• 2 弓形蟲(chóng)病免疫診斷方法研究現(xiàn)狀13-15
• 3 本研究的目的及意義15-16
• 第一部分 弓形蟲(chóng)SAG2、GRA6、GRA7基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建16-35
• 材料16-19
• 方法19-26
• 結(jié)果26-32
• 討論32-35
• 第二部分 弓形蟲(chóng)SAG2、GRA6、GRA7基因的表達(dá)及鑒定35-50
• 材料35-38
• 方法38-43
• 結(jié)果43-47
• 討論47-50
• 第三部分 SAG2、GRA6和GRA7重組抗原的應(yīng)用研究50-54
• 材料50
• 方法50
• 結(jié)果50-51
• 討論51-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 綜述61-73
• 參考文獻(xiàn)67-73
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果73-74
• 致謝74

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1 王建成;什么是弓形蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)病?[J];中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2003年05期

2 袁吉云,張奎,楊汝杰,張蔚;蘇州地區(qū)弓形蟲(chóng)病的初步調(diào)查(摘要)[J];蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1982年01期

3 張秀平;;弓形蟲(chóng)病化學(xué)治療的研究[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(寄生蟲(chóng)病分冊(cè));1984年03期

4 王長(zhǎng)烈;在淋巴結(jié)炎患者中查出弓形蟲(chóng)病[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(寄生蟲(chóng)病分冊(cè));1987年03期

5 孫德建;;布隆迪弓形蟲(chóng)病血清流行病學(xué)調(diào)查[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(寄生蟲(chóng)病分冊(cè));1989年03期

6 邵其峰;趙玉強(qiáng);;全國(guó)弓形蟲(chóng)病防治科研會(huì)議簡(jiǎn)訊[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)病防治雜志;1990年04期

7 甘紹伯,李爽;弓形蟲(chóng)病100例分析[J];中國(guó)人獸共患病雜志;1991年05期

8 崔君兆,馬重麟,陸宙光,于恩庶;診治11例弓形蟲(chóng)病的經(jīng)驗(yàn)和診斷標(biāo)準(zhǔn)的探討[J];中國(guó)人獸共患病雜志;1991年05期

9 薛純良;弓形蟲(chóng)病的現(xiàn)代治療[J];寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志;1991年02期

10 陳珊;眼弓形蟲(chóng)病14例臨床分析[J];實(shí)用眼科雜志;1991年04期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 朱引潔;吳文學(xué);賀國(guó)強(qiáng);;弓形蟲(chóng)病的診斷現(xiàn)狀[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲(chóng)學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

2 李輝;張健;;一例犬弓形蟲(chóng)病的診斷與治療[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)小動(dòng)物醫(yī)學(xué)分會(huì)第四次學(xué)術(shù)研討會(huì)、中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)外科學(xué)分會(huì)第十六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（2）[C];2009年

3 李祥瑞;;弓形蟲(chóng)病的流行的新趨勢(shì)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)食品衛(wèi)生學(xué)分會(huì)第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

4 崔平;秦建華;方素芳;;河北省動(dòng)物弓形蟲(chóng)病流行病學(xué)調(diào)查[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲(chóng)學(xué)分會(huì)第五次代表大會(huì)暨第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

5 藺智兵;張厚雙;曹杰;周勇志;李國(guó)清;周金林;;弓形蟲(chóng)real-time PCR檢測(cè)方法的建立和初步應(yīng)用[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲(chóng)學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

6 楊娜;穆名楊;李紅魁;何建斌;;中國(guó)東北地區(qū)雞源弓形蟲(chóng)的流行病學(xué)調(diào)查[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

7 劉晶;蔡進(jìn)忠;于晉海;夏兆飛;林德貴;劉群;;幾種動(dòng)物弓形蟲(chóng)病血清流行病學(xué)的初步調(diào)查[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲(chóng)學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

8 王權(quán);蔣蔚;荊振宇;陳永軍;楊康;宋寧寧;崔常勇;;五種中藥體外抗弓形蟲(chóng)抑制效果的研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲(chóng)學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

9 鞏薇;衛(wèi)禮;王吉;賀爭(zhēng)鳴;邢瑞昌;;實(shí)驗(yàn)小鼠弓形蟲(chóng)檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[A];中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)第六屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2004年

10 陳西岐;劉秀蘭;張克功;于德順;;貓弓形蟲(chóng)病的診治[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲(chóng)學(xué)分會(huì)第五次代表大會(huì)暨第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

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1 林曉麗;養(yǎng)貓者易感染弓形蟲(chóng)應(yīng)謹(jǐn)防患精神分裂癥[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2007年

2 小郭;弓形蟲(chóng)病危害不輕[N];中國(guó)商報(bào);2000年

3 戴培紅;北京友誼醫(yī)院探索治療弓形蟲(chóng)病的新途徑[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2000年

4 本報(bào)記者 蔡玉冰 通訊員 黃賢君;弓形蟲(chóng)沒(méi)你想的可怕[N];廣東科技報(bào);2012年

5 李水源;當(dāng)前豬場(chǎng)弓形蟲(chóng)病的防控[N];中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào);2013年

6 本報(bào)記者 白軼南;弓形蟲(chóng)病 危及胎兒健康[N];保健時(shí)報(bào);2005年

7 臨城縣畜牧局 李路民;豬得弓形蟲(chóng)病 吃了貓的虧[N];河北科技報(bào);2002年

8 北京友誼醫(yī)院北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所研究員 甘紹伯 副主任醫(yī)師 馮曼玲;弓形蟲(chóng)——寵物的“寵物”[N];健康報(bào);2000年

9 連孝華;孕婦玩貓狗易危害胎兒[N];衛(wèi)生與生活報(bào);2007年

10 王志海 邵芹;犬弓形蟲(chóng)病[N];中國(guó)畜牧報(bào);2003年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 呂剛;弓形蟲(chóng)表面抗原蛋白5的結(jié)構(gòu)分析及免疫學(xué)研究[D];山東大學(xué);2015年

2 龔國(guó)華;上海城區(qū)犬、貓弓形蟲(chóng)病流行病學(xué)調(diào)查及藥物治療的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

3 尹青;弓形蟲(chóng)Δbag1Δku80株的構(gòu)建及其作為貓弓形蟲(chóng)病疫苗候選株的免疫原性、安全性和效力的評(píng)價(jià)[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 徐鵬;弓形蟲(chóng)新毒力基因TgMAPK1表達(dá)特性及其初步功能研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 張步彩;泰州地區(qū)豬弓形蟲(chóng)血清流行病學(xué)調(diào)查及中藥治療急性感染弓形蟲(chóng)小鼠效果的研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

6 陳金鈴;CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞失能參與弓形蟲(chóng)分泌排泄抗原致小鼠早孕流產(chǎn)的機(jī)制[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

7 吳亮;弓形蟲(chóng)“遲發(fā)型死亡”機(jī)制的研究[D];江蘇大學(xué);2012年

8 張東林;弓形蟲(chóng)病分子診斷方法及弓形蟲(chóng)分離株耐藥性的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

9 司進(jìn);弓形蟲(chóng)病免疫診斷及靶向生物治療的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2005年

10 周永華;弓形蟲(chóng)慢性感染大鼠模型的建立及其在學(xué)習(xí)記憶能力影響研究中的應(yīng)用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

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1 楊曉宇;重組弓形蟲(chóng)TRXL蛋白和EN02蛋白免疫保護(hù)力的評(píng)價(jià)[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 蔣宗儒;弓形蟲(chóng)ROP18激酶抑制宿主NF-κB信號(hào)通路的分子機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

3 趙玲瀟;基于泛素-弓形蟲(chóng)多價(jià)抗原的重組疫苗對(duì)小鼠的免疫保護(hù)性研究[D];山東大學(xué);2015年

4 王帥;弓形蟲(chóng)超氧化物歧化酶（SOD）基因分析和克隆表達(dá)[D];山東大學(xué);2015年

5 冷麗;云南大理HIV陽(yáng)性者感染弓形蟲(chóng)SAG1、c22-8基因位點(diǎn)的研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

6 李筱鑫;弓形蟲(chóng)酪蛋白激酶CK1β基因缺失株構(gòu)建[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 蔡玉峰;貓弓形蟲(chóng)抗體ELISA檢測(cè)方法的建立與評(píng)價(jià)[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

8 閆曉月;弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白R(shí)OP7的生物信息學(xué)分析、原核表達(dá)及組織學(xué)定位[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 李芬香;弓形蟲(chóng)TgPRMT5基因的克隆鑒定，，細(xì)胞定位及功能初步分析[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

10 趙東岳;弓形蟲(chóng)B1等基因Real-time PCR與截短SAG2基因克隆、表達(dá)及ELISA建立[D];福建農(nóng)林大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：弓形蟲(chóng)SAG2、GRA6、GRA7基因的重組表達(dá)及應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：398169