本文關(guān)鍵詞：磁靶向基因轉(zhuǎn)染復(fù)合物的構(gòu)建及應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前,傳統(tǒng)疾病治療存在很大的局限性,隨著基因信息技術(shù)的發(fā)展,研究人員對很多疾病的機制有了更深入的了解,由此提出了一種新的疾病治療方法-基因治療。近年來,基因治療已被廣泛應(yīng)用于治療遺傳性疾病。非病毒載體具有制備簡單、無免疫原性、基因裝載量高等特點,在基因治療中有廣泛的應(yīng)用,尤其是陽離子聚合物非病毒載體聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI),具有較高的轉(zhuǎn)染效率,是公認(rèn)的非病毒載體基因轉(zhuǎn)染的金標(biāo)準(zhǔn)。隨著納米材料發(fā)展,磁性納米材料因具有良好的磁學(xué)性能受到研究人員的廣泛關(guān)注。其中,磁性四氧化三鐵(Fe304)納米顆粒以其良好的化學(xué)穩(wěn)定性和優(yōu)異的磁響應(yīng)性在疾病的診斷和治療方面具有重要的應(yīng)用價值。本論文主要內(nèi)容是以磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles, MNPs)和PEI為研究切入點,建立基于PEI的磁靶向基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng),并初步探討了將其應(yīng)用于治療心血管疾病的可能性。具體內(nèi)容包括：1. Fe3O4@PAA納米顆粒的制備利用高溫分解法,分解乙酰丙酮鐵,制備出Fe304納米顆粒,并在其表面修飾上聚丙烯酸(polyacrylic acid, PAA)。利用透射電鏡、傅立葉變換紅外光譜及粒徑電位分析等對所制備的顆粒進(jìn)行了系統(tǒng)的表征研究。結(jié)果顯示,PAA成功修飾到Fe304納米顆粒上,所制備出的Fe3O4@PAA磁性納米顆粒粒徑均一,約為7-10nm,表面具有可觀的負(fù)電荷,分散性良好,具有超順磁性。2. PEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染性能評價利用細(xì)胞毒性分析、凝膠阻滯分析、粒徑電位分析等方法,探討了PEI作為基因載體的可行性并優(yōu)化了轉(zhuǎn)染條件。結(jié)果顯示,PEI在低濃度時細(xì)胞毒性較低,可用于細(xì)胞實驗,且具有很強的DNA結(jié)合濃縮能力,在較低的N/P值條件下就能與DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物。復(fù)合物粒徑較小,在145-160nm之間,表面具有可觀的正電荷。在無血清條件下,PEI/DNA復(fù)合物在N/P=10時轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高(94.9%)。3.基于PEI的磁靶向基因轉(zhuǎn)染復(fù)合物的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染性能評價MNPs、PEI和DNA通過靜電自組裝的方式形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物,通過細(xì)胞毒性分析、凝膠阻滯分析、粒徑電位分析等方法,考察了MNPs/PEI的載體性能,并對其實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示,MNPs/PEI在低濃度時細(xì)胞毒性較低,比PEI毒性稍高,但處于可接受范圍內(nèi),可用于細(xì)胞實驗。MNPs/PEI結(jié)合DNA的能力較PEI稍有減弱,但仍具有可觀的DNA結(jié)合能力,可用作基因載體。MNPs/PEI/DNA復(fù)合物具有較小的粒徑,在174-196nm之間,表面具有可觀的正電荷。在磁場中可以增強轉(zhuǎn)染效率。在PEI/DNA (N/P)=10、MNPs/DNA (v/w)=0.25、無血清、加磁場20min的條件下,轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高。4.磁靶向敲除PCSK9基因研究枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶9 (Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin type 9, PCSK9)基因通過介導(dǎo)低密度脂蛋白受體(Low Density Lipoprotein Receptor, LDLR)降解,調(diào)節(jié)血漿低密度脂蛋白膽固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol, LDL-C)水平,與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本論文將優(yōu)化后的磁靶向基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas) systems)基因敲除技術(shù)相結(jié)合,通過設(shè)計具有靶序列特異性的gRNA (guide RNA)序列引導(dǎo),考察是否能成功地對PCSK9基因進(jìn)行定點敲除。結(jié)果表明,在已有實驗中尚未得到理想的結(jié)果,其原因可能是CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)具有相對較高的脫靶效應(yīng)和單個切口的雙鏈斷裂激發(fā)的細(xì)胞自我修復(fù)導(dǎo)致基因敲除概率較低。后續(xù)尚需進(jìn)行深入研究。
【關(guān)鍵詞】：基因治療 磁性納米顆粒 聚乙烯亞胺 磁靶向基因轉(zhuǎn)染 基因敲除
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R450
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 緒論11-33
• 1.1 前言11
• 1.2 磁性納米顆粒的制備及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用11-14
• 1.2.1 磁性納米顆粒的制備方法12
• 1.2.2 磁性納米粒子的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用12-14
• 1.3 基因治療及其載體研究概況14-18
• 1.3.1 基因治療概述14
• 1.3.2 基因治療常用方法14-15
• 1.3.3 基因轉(zhuǎn)染過程及障礙15-16
• 1.3.4 基因轉(zhuǎn)染載體研究現(xiàn)狀16-18
• 1.4 基于PEI的磁靶向基因轉(zhuǎn)染技術(shù)研究概述18-20
• 1.4.1 PEI轉(zhuǎn)染機制18
• 1.4.2 基于PEI的磁靶向基因轉(zhuǎn)染18-20
• 1.5 基因敲除技術(shù)研究進(jìn)展20-22
• 1.5.1 TALENs敲除機制20-21
• 1.5.2 CRISPR/Cas9敲除機制21-22
• 1.6 本研究的目的和意義22-23
• 參考文獻(xiàn)23-33
• 第二章 單分散磁性Fe_3O_4@PAA納米顆粒的制備33-41
• 2.1 前言33
• 2.2 實驗材料與方法33-35
• 2.2.1 實驗試劑與儀器33-34
• 2.2.2 實驗方法34-35
• 2.3 實驗結(jié)果與討論35-38
• 2.3.1 Fe_3O_4與Fe_3O_4@PAA的制備35
• 2.3.2 磁性納米顆粒的FT-IR光譜圖35-36
• 2.3.3 磁性納米顆粒的粒徑和電位分析36-37
• 2.3.4 磁性納米顆粒的磁滯回歸曲線37-38
• 2.4 本章小結(jié)38-39
• 參考文獻(xiàn)39-41
• 第三章 PEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染性能評價41-51
• 3.1 前言41
• 3.2 實驗材料與方法41-44
• 3.2.1 實驗試劑與儀器41-42
• 3.2.2 實驗方法42-44
• 3.3 實驗結(jié)果與討論44-48
• 3.3.1 載體PEI的細(xì)胞毒性44-45
• 3.3.2 瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗45
• 3.3.3 PEI/pDNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的粒徑和Zeta電位檢測45-46
• 3.3.4 不同N/P值對轉(zhuǎn)染效率的影響46-47
• 3.3.5 血清對轉(zhuǎn)染效率的影響47-48
• 3.4 本章小結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-51
• 第四章 基于PEI的磁靶向基因轉(zhuǎn)染復(fù)合物的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染性能評價51-65
• 4.1 前言51-52
• 4.2 實驗材料與方法52-54
• 4.2.1 實驗試劑與儀器52
• 4.2.2 實驗方法52-54
• 4.3 實驗結(jié)果與討論54-61
• 4.3.1 磁靶向基因轉(zhuǎn)染載體的細(xì)胞毒性54-55
• 4.3.2 瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗55
• 4.3.3 MNPs/PEI/pDNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的粒徑和Zeta電位檢測55-56
• 4.3.4 不同v/w值對轉(zhuǎn)染效率的影響56-57
• 4.3.5 不同N/P值對轉(zhuǎn)染效率的影響57-58
• 4.3.6 血清對轉(zhuǎn)染效率的影響58-59
• 4.3.7 加磁場時間對轉(zhuǎn)染效率的影響59-60
• 4.3.8 不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率60-61
• 4.3.9 普魯士藍(lán)染色61
• 4.4 本章小結(jié)61-62
• 參考文獻(xiàn)62-65
• 第五章 磁靶向敲除PCSK9基因研究65-73
• 5.1 前言65
• 5.2 實驗材料與方法65-69
• 5.2.1 實驗試劑與儀器65-66
• 5.2.2 實驗方法66-69
• 5.3 實驗結(jié)果與討論69-70
• 5.3.1 人PCSK9基因CRISPR/Cas9質(zhì)粒設(shè)計與構(gòu)建69-70
• 5.3.2 基因敲除分析70
• 5.4 本章小結(jié)70-71
• 參考文獻(xiàn)71-73
• 第六章 總結(jié)與展望73-75
• 6.1 總結(jié)73-74
• 6.2 展望74-75
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文75-77
• 致謝77

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