目的:探討嗜鉻粒蛋白A（chromogranin,CGA）衍生多肽bCAT聯(lián)合卡泊芬凈（caspofungin,CAS）及載bCAT納米粒子（bCAT-NPs）聯(lián)合超聲對(duì)白色念珠菌生物被膜作用及可能機(jī)制。方法:以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC10231為研究對(duì)象,XTT法檢測(cè)bCAT聯(lián)合CAS及bCAT-NPs聯(lián)合超聲作用后生物被膜代謝活性的變化,并計(jì)算抗生物被膜50%的MIC(MBIC₅₀),倒置顯微鏡觀察生物被膜形態(tài)變化,RT-PCR檢測(cè)黏附因子ALS3的mRNA表達(dá),激光共聚焦（confocal laser scanning microscopy,CLSM）觀察生物被膜通透性的變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析,采用Dunnett T3檢驗(yàn)進(jìn)行組內(nèi)兩兩比較。結(jié)果:bCAT及CAS抗生物被膜的MBIC₅₀分別為1280μmol/L、128μg/mL,兩者聯(lián)合使用時(shí)抗被膜的MBIC₅₀分別降至320μmol/L、4μg/mL,RT-PCR發(fā)現(xiàn)bCAT+CAS組處理被膜后ALS3表達(dá)量為1.71±0.65%,與control、bCAT... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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XTT法檢測(cè)被膜代謝活性Figure1.ThemetabolicactivityofbiofilmwasdetectedbyXTTassay

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文16(2)白色念珠菌凍干粉恢復(fù)培養(yǎng)：用無(wú)菌吸管吸取500μlYPD液體培養(yǎng)基，加入至安瓿管內(nèi)，振蕩，使凍干粉完全溶解呈懸浮狀。吸取全部菌體懸浮液，移植于2個(gè)麥芽汁瓊脂平板上，置于37℃孵箱培養(yǎng)24~48h。(3)菌株傳代：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上觀察到單個(gè)菌落生成，酒精燈燒灼接種環(huán)后，刮取適量菌落以劃線法涂抹于SDA平板上，37℃浮箱培養(yǎng)24~48h。(4)SDA平板觀察單個(gè)菌落生成，挑取單個(gè)菌落置于裝有2mlYPD液體培養(yǎng)基的離心管中，100rpm，37℃培養(yǎng)24h。(5)凍存菌種：搖勻YPD培養(yǎng)基中的白色念珠菌懸液，使用微量移液槍吸取600μl的菌液置于1.5ml凍存管中，再加入400μl石蠟油作為凍存保護(hù)液（石蠟油與菌液按4:6比例）。標(biāo)記凍存菌株編號(hào)及日期，將凍存管置于-80℃保存。(6)生物被膜培養(yǎng)：-80℃取出凍存菌液，迅速溶解，使用燒灼后的接種環(huán)沾取適量菌液通過(guò)劃線法接種于SDA平板上，置于37.0℃孵箱培養(yǎng)24h以形成單個(gè)菌落。挑選單個(gè)菌落接種于YPD培養(yǎng)基中37.0℃、100rpm培養(yǎng)24h，隨后使用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為106cells/ml。96孔板中加入100μl菌液，另加入100μlRPMI-1640培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照（每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)三個(gè)復(fù)孔），包裹保鮮膜后37℃培養(yǎng)24h，PBS清洗底部未黏附真菌細(xì)胞，通過(guò)XTT法檢測(cè)生物被膜形成能力，判斷標(biāo)準(zhǔn)為[22]：OD≤ODc，無(wú)生物被膜形成能力；ODc＜OD≤2ODc，較弱生物被膜形成能力；2ODc＜OD≤4ODc，中等生物被膜形成能力；OD＞4ODc，強(qiáng)生物被膜形成能力。其中ODc表示空白組OD值，OD為實(shí)驗(yàn)組OD值。圖2.SDA平板培養(yǎng)白色念珠菌Figure2.C.albicanswereculturedwithSDAplate

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文19標(biāo)準(zhǔn)，與control組相比有強(qiáng)形成生物被膜能力。表2.菌株ATCC10231生物被膜的形成能力Table2.TheabilityofATCC10231toformbiofilmOD490nm形成被膜能力ATCC102310.76±0.05強(qiáng)空白對(duì)照組0.08±0.01-判斷標(biāo)準(zhǔn)：OD≤ODc，無(wú)生物被膜形成能力；ODc＜OD≤2ODc，較弱生物被膜形成能力；2ODc＜OD≤4ODc，中等生物被膜形成能力；OD＞4ODc，強(qiáng)生物被膜形成能力。其中ODc表示空白組OD值，OD為實(shí)驗(yàn)組OD值。4.2bCAT及CAS抗生物被膜能力經(jīng)XTT發(fā)現(xiàn)，bCAT及CAS抗生物被膜MBIC50分別為1280μmol/L、128μg/mL。bCAT濃度為1280μmol/L時(shí)，生物被膜代謝活性為44.25±5.26%，不同bCAT濃度比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=55.71，P＜0.05），兩兩比較發(fā)現(xiàn)各組與1280μmol/L組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05（圖3A）。不同濃度CAS作用后生物被膜活性改變?nèi)鐖D3B所示，當(dāng)CAS濃度為128μg/mL時(shí)，被膜代謝活性為41.99±11.88%，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=44.43，P＜0.05），兩兩比較發(fā)現(xiàn)各組與128μg/mL組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。圖3.bCAT及CAS抑制白色念珠菌生物被膜的作用。圖3A，bCAT對(duì)白色念珠菌生物被膜代謝活性的影響。圖3B，CAS對(duì)白色念珠菌生物被膜代謝活性的影響。*表示與bCAT濃度為1280μmol/L及CAS濃度為128μg/mL比，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]多肽bCAT通過(guò)下調(diào)白念珠菌HWP1基因表達(dá)抑制生物被膜的形成機(jī)制[J]. 許珊,張舒,張丹,劉思佚,劉梳柯.  中國(guó)感染與化療雜志. 2017(04)
[2]CHR抑制白假絲酵母菌生物被膜形成作用及機(jī)制探討[J]. 張舒,許珊,張丹,黃文祥,魏伏,劉思佚,羅盛淑,何琴,李佳俊.  重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2016(10)



本文編號(hào)：3624401