目的:探究microRNA-140-5p（miR-140-5p）對(duì)膿毒癥樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cell,DC）表型及功能的影響。方法:⑴取人外周血提取單核細(xì)胞,以人重組細(xì)胞因子白介素4（IL-4）及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）誘導(dǎo)分化體外培養(yǎng)單核細(xì)胞來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞（monocyte-derived dendritic cells,MoDC）。⑵實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理方法:對(duì)照組:在MoDC體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的第五天加入1ug/ml的LPS培養(yǎng)48小時(shí);膿毒癥模型組:培養(yǎng)全過(guò)程以1ug/ml的LPS給與持續(xù)刺激;膿毒癥+轉(zhuǎn)染處理組:同膿毒癥模型組處理,在培養(yǎng)的第5天轉(zhuǎn)染（miR-140-5p mimics、inhibitor及相應(yīng)的對(duì)照miR-NC）培養(yǎng)12小時(shí)后再加1ug/ml濃度的LPS處理48小時(shí)。⑶細(xì)胞流式檢測(cè)不同處理組樹(shù)突狀細(xì)胞表面共刺激分子（CD80、CD86及HLA-DR）的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況⑷熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的胞內(nèi)熒光信號(hào);熒光定量PCR（q-PCR）檢測(cè)不同處理組DC miR-140-5P表達(dá)情況。⑸酶標(biāo)儀檢測(cè)不同處理組DC促T細(xì)胞增殖作用的變化... 

【文章來(lái)源】：南昌大學(xué)江西省211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：53 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

的演示方法，取2支SepMate-50RUO離心管，向管中加15mlLymphoprep單個(gè)核細(xì)胞梯度離心液，水平旋子離心機(jī)1000轉(zhuǎn)離心1分鐘取出圖1-1.SEPMATE梯度離心的演示圖例

一、LPS刺激對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)、凋亡及胞內(nèi)miR-140-5p表達(dá)的影響10表1-4.U6qPCRReactionReagentVolume(μl)ddH2O9TBGreenAdvantagePremix(2X)12.5ROXDye(50X)0.5U6ForwardPrimer(10μM)0.5U6ReversePrimer(10μM)0.5cDNA2Totalvolume25⑶核酸電泳：30mlTAE緩沖液溶解0.3g瓊脂糖，微波爐加熱2分鐘以溶解完全。待膠液稍冷卻后加入3ulGel-Red顯色劑混勻，緩慢倒入準(zhǔn)備好的制膠槽位（10孔梳子）內(nèi)，30分鐘膠可凝固；把膠準(zhǔn)確放入電泳槽中（樣品孔位于負(fù)極），加TAE緩沖液作為電泳緩存液，將miRNA反轉(zhuǎn)擴(kuò)增的產(chǎn)物與上樣緩沖液（6×）按比例混勻，加入樣品槽中。接通電源后，調(diào)節(jié)電壓100V電泳，直至樣本藍(lán)色指示帶接近膠邊緣停止電泳。將膠取出后，于凝膠成像系統(tǒng)中觀(guān)察凝膠中發(fā)熒光的目的條帶并拍照記錄。1.1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以GraphPad8.0軟件處理數(shù)據(jù)，所有的數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較計(jì)量資料，以P值＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.2.1人外周血單核細(xì)胞來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)磁珠分選得到外周血單核細(xì)胞，流式檢測(cè)鑒定CD14+單核細(xì)胞純度在95%以上，符合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)要求，見(jiàn)圖1-2（A、B、C）；樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，第5天收獲iDC流式檢測(cè)鑒定其細(xì)胞純度，光鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1-3。圖1-2流式檢測(cè)CD14+細(xì)胞純度圖注:A：流式圈定單個(gè)核細(xì)胞；B：CD45+細(xì)胞；C：CD45+/CD14+細(xì)胞；D：CCR5+細(xì)胞

一、LPS刺激對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)、凋亡及胞內(nèi)miR-140-5p表達(dá)的影響111.2.2膿毒癥DCmiR-140-5P表達(dá)明顯降低對(duì)提取的總RNA加尾反轉(zhuǎn)后，進(jìn)一步擴(kuò)增miRNA反轉(zhuǎn)得到的DNA片段，核酸電泳顯示在100bp之下可見(jiàn)miR-140-5P的目的條帶，q-PCR的進(jìn)一步檢測(cè)對(duì)照組及體外膿毒癥模型兩組間的miR-140-5P的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，體外膿毒癥模型miR-140-5P表達(dá)明顯降低（p＜0.01）。每次q-PCR實(shí)驗(yàn)均保證溶解曲線(xiàn)峰的單一性以排除非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾。見(jiàn)圖1-4，圖1-5。圖1-3樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的光鏡下觀(guān)察圖片圖1-4A:miR-140-5P擴(kuò)增產(chǎn)物核酸電泳圖B：對(duì)照組(NC)及膿毒癥組(LPS+)DCmiR-140-5P的表達(dá)**表示與對(duì)照組相比，膿毒癥組（LPS刺激組）miR-140-5P表達(dá)有顯著差異（p＜0.01）

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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