目的:本研究主要將核酸納米花（NFs）與RNA激活（RNAa）技術(shù)聯(lián)用在啟動(dòng)子水平上探究miR-155在炎癥發(fā)生過程中的作用機(jī)制以及miR-155與其靶基因共表達(dá)后對炎癥發(fā)生的作用影響,以期實(shí)現(xiàn)對重大疾病的早期預(yù)警,為炎癥的預(yù)防、相關(guān)疾病的治療和阻止其惡化提供新思路。方法:1.通過優(yōu)化連接反應(yīng)和滾環(huán)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的條件、表征NFs的形態(tài)大小、檢測NFs對細(xì)胞的毒性作用、入胞效率和作用效果,構(gòu)建具RNAa作用的NFs。2.根據(jù)saRNA設(shè)計(jì)原則查找出可激活miR-155的序列、利用CCK-8法檢測細(xì)胞毒性、RT-qPCR法檢測miR-155表達(dá)情況從而篩選出可高效激活miR-155的saRNA;隨后通過對比細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞遷移能力以及炎癥相關(guān)效應(yīng)因子表達(dá)情況從而證實(shí)miR-155在炎癥發(fā)生過程中的作用機(jī)制。3.根據(jù)預(yù)測的miR-155靶基因及其富集通路,探究激活miR-155及其靶基因后探究二者共表達(dá)后相互作用對細(xì)胞的影響。結(jié)果:1.對NFs的成環(huán)過程與擴(kuò)增過程的反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,選用高連接效率的T4 DNA連接酶、模板與引物濃度比為1:1、將雜交時(shí)間優(yōu)化為2 h和連接時(shí)間優(yōu)化為3 h、原料... 

【文章來源】：華僑大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：99 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

miR-155的形成過程

5圖1.2miR-155在免疫細(xì)胞中的調(diào)控作用1.1.4miR-155-SHIP1-PI3K-AKT信號通路對miR-155的靶基因預(yù)測我們發(fā)現(xiàn)SHIP1是miR-155的靶標(biāo)，且在SHIP1的3’-UTR中有保守的八聚體靶“種子”，具有高度保守的miR-155結(jié)合位點(diǎn)。SHIP1是肌醇5磷酸酶家族的成員之一，主要由造血區(qū)室中的細(xì)胞表達(dá)；其功能是調(diào)控造血干細(xì)胞的生長、分化和作用發(fā)揮。在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）中，TNF-α誘導(dǎo)miR-155過表達(dá)，隨后過表達(dá)的miR-155阻斷SHIP1，并進(jìn)一步增強(qiáng)TNF-α的促炎作用[24]。Viernes等[36]研究證明了SHIP1是炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，可通過下調(diào)AKT的活性來抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）炎癥信號通路的傳導(dǎo)途徑。PI3K-AKT信號通路是經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和周期進(jìn)程和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。其信號過度激活可作用下游多種因子如促進(jìn)MMP和mTOR的表達(dá)、將FOXO和p53磷酸化從而喪失活性、促進(jìn)血管生成、激活I(lǐng)κB激酶（InhibitorKappaBKinase，IKK）信號體復(fù)合物從而激活NF-кB信號通路最終引起miR-155的表達(dá)增加。因此，過表達(dá)的miR-155靶向SHIP1導(dǎo)致AKT活化延長，從而正反饋炎癥信號通路，促使炎癥持續(xù)進(jìn)行[37]。綜上可知，炎癥反應(yīng)發(fā)生后miR-155將過表達(dá)并參與炎癥反應(yīng)，過表達(dá)的miR-155與炎癥反應(yīng)的發(fā)展密切相關(guān)，甚至還能誘導(dǎo)癌癥發(fā)生。然而，這些研究只能證明miR-155過表達(dá)后在相關(guān)信號通路和免疫細(xì)胞的調(diào)控中是重要的參與者，在miR-155表達(dá)增加的同時(shí)，其他相關(guān)炎性因子表達(dá)也增加。因此，關(guān)于miR-155的研究亟需從其源頭上加以關(guān)注——若無外界炎性物質(zhì)刺激，僅增加miR-155的表達(dá)，是否能引起炎癥的發(fā)生？

8（8）靶標(biāo)的3’端具有比其5’端熱力學(xué)穩(wěn)定性低。Ago2在saRNA相對于其3"末端的5’末端使用具有較低熱力學(xué)穩(wěn)定性的鏈作為指導(dǎo)。（9）第7個(gè)堿基是“T”；第19位堿基是“A”；第18位是“A”或“T”，最好是“A”。RNAa現(xiàn)象早在1969年就被發(fā)現(xiàn)[45]，但當(dāng)時(shí)未引起關(guān)注，在近10年各位學(xué)者才對其重視。RNAa通過激活內(nèi)源性靶基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的基因功能恢復(fù)，可恢復(fù)不同基因的功能作用。與傳統(tǒng)的基因過表達(dá)技術(shù)相比，RNAa技術(shù)顯示出操作簡單快捷、實(shí)驗(yàn)周期較短、實(shí)驗(yàn)成本低等特點(diǎn)，為其用于實(shí)驗(yàn)探究提供了諸多優(yōu)勢。由于saRNA在基因調(diào)控、表觀遺傳、疾病治療等方面具有相當(dāng)大的應(yīng)用潛力，鑒于其諸多優(yōu)勢，RNAa可作為一種極有潛力的新型基因干預(yù)治療手段。且Dar研究團(tuán)隊(duì)[46]建立了saRNA數(shù)據(jù)庫（http://bioinfo.imtech.res.in/manojk/sarna/）來收集已驗(yàn)證有效的saRNA的詳細(xì)資料，用以基于基因治療的研究。因此，RNAa這一技術(shù)的研究與應(yīng)用也提示我們，在源頭上探究miR-155在炎癥中的作用機(jī)制，可通過利用RNAa僅將miR-155的宿主基因激活使其自主形成成熟的miR-155，從而研究其在炎癥發(fā)生過程中的作用機(jī)制，此技術(shù)也可大大降低實(shí)驗(yàn)技術(shù)的難點(diǎn)與減少實(shí)驗(yàn)周期。圖1.3RNAa的作用過程

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：3529392