發(fā)布時間：2021-12-02 20:46

　　目的:1、通過構建CRISPR/Cas9慢病毒載體,感染SMMC-7721細胞,獲得穩(wěn)定表達Cas9蛋白的SMMC-7721-Cas9細胞以及My D88基因敲除的SMMC-7721-My D88-/-/My D88+/+混合細胞,搭建CRISPR/Cas9基因編輯平臺。2、SMMC-7721-My D88-/-單克隆細胞的篩選與敲除鑒定。方法:1、CRISPR/Cas9基因編輯平臺的搭建:（1）設計合成My D88基因特異性的3對sg RNA（sg RNA-1、sg RNA-2、sg RNA-3）,并將其連接到表達質粒GV375上,重組的GV375表達質粒與包裝質粒共轉染到293T細胞內,產生慢病毒顆粒,并通過熒光法檢測病毒滴度;（2）確定慢病毒感染的最適MOI,以及嘌呤霉素篩選的最適劑量;（3）首先將Lenti-Cas9-puro慢病毒感染SMMC-7721細胞,經嘌呤霉素篩選得到SMMC-7721-Cas9細胞,然后用Lenti-sg RNA-Cherry病毒感染SMMC-7721-Cas9細胞,獲得SMMC-7721-My D88-/-/My D88+/+混合細胞,并通過PCR... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學安徽省

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學位級別】：碩士

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本文編號：3529181