促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑對(duì)病原真菌生長(zhǎng)、形態(tài)建成、侵染結(jié)構(gòu)分化、次生代謝、致病性及滲透脅迫響應(yīng)等多種生理功能具有調(diào)節(jié)作用,其調(diào)控作用因病原物種類(lèi)、互作系統(tǒng)而異。為進(jìn)一步闡明Hog1與Slt2-MAP激酶是否參與及如何調(diào)控Alternaria alternata響應(yīng)梨果表皮疏水性和蠟質(zhì)信號(hào)從而啟動(dòng)侵染的過(guò)程,本試驗(yàn)在藥理學(xué)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)梨果致病真菌A.alternata（JT-03）MAPK基因Hog1、Slt2進(jìn)行鑒定、克隆和生物信息學(xué)分析,并構(gòu)建缺失突變株和回復(fù)菌株,從分子水平上系統(tǒng)研究了Hog1和Slt2的生物學(xué)功能及對(duì)A.alternata響應(yīng)梨果皮蠟質(zhì)物化信號(hào)進(jìn)而啟動(dòng)侵染的調(diào)控機(jī)制,結(jié)果如下:1.藥理學(xué)結(jié)果表明MAPK特異性的抑制劑SB203580可顯著地抑制梨果蠟質(zhì)和疏水性誘導(dǎo)的A.alternata孢子萌發(fā)及附著胞的形成,同時(shí)也減弱了A.alternata對(duì)早酥梨的致病能力。2.對(duì)Hog1、Slt2-MAP激酶進(jìn)行基因克隆后分別得到大小為1615bp和1747bp的克隆產(chǎn)物AaHog1和... 

【文章來(lái)源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省

【文章頁(yè)數(shù)】：90 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

信號(hào)傳導(dǎo)模式圖

Hog1、Slt2-MAP激酶對(duì)梨果蠟質(zhì)及疏水性誘導(dǎo)Alternariaalternata侵染結(jié)構(gòu)分化的調(diào)控用19圖2同源重組敲除法示意圖Fig.2Schematicofhomologousrecombinationknockout表4擴(kuò)增AaHog1-up,AaHog1-down,AaSlt2-up和AaSlt2-down基因所用到引物。Table4PrimersusedforamplicationofAaHog1-up,AaHog1-down,AaSlt2-upandAaSlt2-down.GenePrimersequences(5"-3")AaHog1-upF:ACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGATAGCCGCAGCATACCATTR:GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGCTCCGAGGGATCTTTCTTGTAaHog1-downF:CATGCATGGTTGCCTAACTCGGCGCGCCTTGATGCGGCGGCACAGGAGR:GACGGCCAGTGCCAAGCTTCGGCGCGCCCGGCGGAGGGTAAAGTAGGAAaSlt2-upF:ACAGCTATGACCATGATTACGAATTCCAGAAGTGGCGATTGTGGGCR:GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGCAGGAGTCGAGCAGCAGAGAaSlt2-downF:TTGCCTAACTCGGCGCGCCGAAGCTTAGAGCGTGAAGGATTTGGGTAR:GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATCACATCAGCAGCGGAGAA2.2.9.1線(xiàn)性化載體的制備構(gòu)建線(xiàn)性化目的基因敲除載體時(shí)所用的載體是pCAMBIA1300（Neo），接下來(lái)用Sac-Ⅰ和Xba-Ⅰ分別單酶切載體，酶切體系為150μL：80μLNeo，3μLSac-Ⅰ，3μLXba-Ⅰ，15μL10×buffer，49μLddH20，反應(yīng)條件為37℃，2h。2.2.9.2上下同源臂與pCHPH的重組反應(yīng)將上下同源臂的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行膠回收，然后根據(jù)所得膠回收產(chǎn)物濃度計(jì)算目的基因反應(yīng)體系，體系如下：3μL目的片段，1.5μL線(xiàn)性載體，4μL5×CEⅡbuffer，2μLExnaseⅡ，9.5μLddH20。在37℃反應(yīng)30min即可完成重組反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)兩線(xiàn)性化DNA的體外環(huán)化。2.2.9.3基因敲除載體的轉(zhuǎn)化將重組產(chǎn)物與大腸桿菌感受態(tài)DH5α混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，步驟同2.2.7.3。

Hog1、Slt2-MAP激酶對(duì)梨果蠟質(zhì)及疏水性誘導(dǎo)Alternariaalternata侵染結(jié)構(gòu)分化的調(diào)控用21經(jīng)過(guò)44h后，觀察玻璃紙上是否有白色菌絲長(zhǎng)出，從長(zhǎng)出來(lái)的平板上揭下該玻璃紙后將其轉(zhuǎn)移到含有潮霉素B（40μg/mL）和羧芐青霉素鈉（500μg/mL）的PDA固體培養(yǎng)基平板上，并繼續(xù)放在28°C恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行正常的培養(yǎng)。培養(yǎng)至2~3d后，觀察是否有長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子。若有轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)則將其從玻璃紙上挑取出來(lái)，轉(zhuǎn)移到新的PDA固體培養(yǎng)基平板（含潮霉素250μg/mL，羧芐青霉素鈉500μg/mL）上培養(yǎng)2~3d。接下來(lái)將轉(zhuǎn)化子在含抗生素和不含抗生素的平板上反復(fù)交替接種3次，以確�？剐赃z傳穩(wěn)定性。2.2.11轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定2.2.11.1基因敲除突變株的PCR鑒定圖3轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證方法和引物位置示意圖.Fig.3Schematicofthemethodoftransformantsscreeningandthelocationsoftheprimersused表5基因敲除實(shí)驗(yàn)中鑒定各突變株所使用的引物序列.Table5TheprimersusedforidentificationofthemutantsofthePCRproductinthegeneknockout.assayGenePrimersequences(5"-3")AaHog1-up-F1TCGGGTGGGTTACAACAGAAAaHog1-down-R1GTCCCTCCTGGTTCTTTAGCAaSlt2-up-F1TCGGAGAAGGAGTCTATGGTGAaSlt2-down-R1CCACATCACTGTTCTGTTACGCTrpCFTAGAGTAGATGCCGACCGGOliCRCTGAAAGCACGAGATTCTTC由于野生型中不存在HPH（olic-Hph-trpc）片段，因此用圖3中所示的引物（引物序列如表5所示）不能擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，而突變株可得到相應(yīng)大小的條帶，因此利用這一差異進(jìn)行突變株的鑒定。ΔAaHog1與ΔAaSlt2用AaHog1-up-F1/OliC-R和

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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