促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）級聯(lián)信號途徑對病原真菌生長、形態(tài)建成、侵染結構分化、次生代謝、致病性及滲透脅迫響應等多種生理功能具有調節(jié)作用,其調控作用因病原物種類、互作系統(tǒng)而異。為進一步闡明Hog1與Slt2-MAP激酶是否參與及如何調控Alternaria alternata響應梨果表皮疏水性和蠟質信號從而啟動侵染的過程,本試驗在藥理學試驗的基礎上,對梨果致病真菌A.alternata（JT-03）MAPK基因Hog1、Slt2進行鑒定、克隆和生物信息學分析,并構建缺失突變株和回復菌株,從分子水平上系統(tǒng)研究了Hog1和Slt2的生物學功能及對A.alternata響應梨果皮蠟質物化信號進而啟動侵染的調控機制,結果如下:1.藥理學結果表明MAPK特異性的抑制劑SB203580可顯著地抑制梨果蠟質和疏水性誘導的A.alternata孢子萌發(fā)及附著胞的形成,同時也減弱了A.alternata對早酥梨的致病能力。2.對Hog1、Slt2-MAP激酶進行基因克隆后分別得到大小為1615bp和1747bp的克隆產物AaHog1和... 

【文章來源】：甘肅農業(yè)大學甘肅省

【文章頁數】：90 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

信號傳導模式圖

Hog1、Slt2-MAP激酶對梨果蠟質及疏水性誘導Alternariaalternata侵染結構分化的調控用19圖2同源重組敲除法示意圖Fig.2Schematicofhomologousrecombinationknockout表4擴增AaHog1-up,AaHog1-down,AaSlt2-up和AaSlt2-down基因所用到引物。Table4PrimersusedforamplicationofAaHog1-up,AaHog1-down,AaSlt2-upandAaSlt2-down.GenePrimersequences(5"-3")AaHog1-upF:ACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGATAGCCGCAGCATACCATTR:GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGCTCCGAGGGATCTTTCTTGTAaHog1-downF:CATGCATGGTTGCCTAACTCGGCGCGCCTTGATGCGGCGGCACAGGAGR:GACGGCCAGTGCCAAGCTTCGGCGCGCCCGGCGGAGGGTAAAGTAGGAAaSlt2-upF:ACAGCTATGACCATGATTACGAATTCCAGAAGTGGCGATTGTGGGCR:GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGCAGGAGTCGAGCAGCAGAGAaSlt2-downF:TTGCCTAACTCGGCGCGCCGAAGCTTAGAGCGTGAAGGATTTGGGTAR:GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATCACATCAGCAGCGGAGAA2.2.9.1線性化載體的制備構建線性化目的基因敲除載體時所用的載體是pCAMBIA1300（Neo），接下來用Sac-Ⅰ和Xba-Ⅰ分別單酶切載體，酶切體系為150μL：80μLNeo，3μLSac-Ⅰ，3μLXba-Ⅰ，15μL10×buffer，49μLddH20，反應條件為37℃，2h。2.2.9.2上下同源臂與pCHPH的重組反應將上下同源臂的PCR擴增產物與酶切產物經過凝膠電泳檢測后進行膠回收，然后根據所得膠回收產物濃度計算目的基因反應體系，體系如下：3μL目的片段，1.5μL線性載體，4μL5×CEⅡbuffer，2μLExnaseⅡ，9.5μLddH20。在37℃反應30min即可完成重組反應，從而實現兩線性化DNA的體外環(huán)化。2.2.9.3基因敲除載體的轉化將重組產物與大腸桿菌感受態(tài)DH5α混合后進行轉化，步驟同2.2.7.3。

Hog1、Slt2-MAP激酶對梨果蠟質及疏水性誘導Alternariaalternata侵染結構分化的調控用21經過44h后，觀察玻璃紙上是否有白色菌絲長出，從長出來的平板上揭下該玻璃紙后將其轉移到含有潮霉素B（40μg/mL）和羧芐青霉素鈉（500μg/mL）的PDA固體培養(yǎng)基平板上，并繼續(xù)放在28°C恒溫培養(yǎng)箱中進行正常的培養(yǎng)。培養(yǎng)至2~3d后，觀察是否有長出轉化子。若有轉化子出現則將其從玻璃紙上挑取出來，轉移到新的PDA固體培養(yǎng)基平板（含潮霉素250μg/mL，羧芐青霉素鈉500μg/mL）上培養(yǎng)2~3d。接下來將轉化子在含抗生素和不含抗生素的平板上反復交替接種3次，以確保抗性遺傳穩(wěn)定性。2.2.11轉化子的篩選及鑒定2.2.11.1基因敲除突變株的PCR鑒定圖3轉化子驗證方法和引物位置示意圖.Fig.3Schematicofthemethodoftransformantsscreeningandthelocationsoftheprimersused表5基因敲除實驗中鑒定各突變株所使用的引物序列.Table5TheprimersusedforidentificationofthemutantsofthePCRproductinthegeneknockout.assayGenePrimersequences(5"-3")AaHog1-up-F1TCGGGTGGGTTACAACAGAAAaHog1-down-R1GTCCCTCCTGGTTCTTTAGCAaSlt2-up-F1TCGGAGAAGGAGTCTATGGTGAaSlt2-down-R1CCACATCACTGTTCTGTTACGCTrpCFTAGAGTAGATGCCGACCGGOliCRCTGAAAGCACGAGATTCTTC由于野生型中不存在HPH（olic-Hph-trpc）片段，因此用圖3中所示的引物（引物序列如表5所示）不能擴增出相應的條帶，而突變株可得到相應大小的條帶，因此利用這一差異進行突變株的鑒定。ΔAaHog1與ΔAaSlt2用AaHog1-up-F1/OliC-R和

【參考文獻】：
期刊論文
[1]果蔬制品中鏈格孢霉毒素檢測與控制研究進展[J]. 王琦,蔡瑞,王周利,岳田利,崔璐.  食品安全質量檢測學報. 2020(01)
[2]白念珠菌Ras/cAMP/PKA途徑研究進展[J]. 黃倩,管國波,黃廣華,魏羽佳.  菌物研究. 2019(04)
[3]辣椒疫霉MAPK基因家族的鑒定及生物信息學分析[J]. 朱彤彤,楊磊,孫文秀.  生物技術. 2018(05)
[4]采后亞精胺處理對‘早酥梨’黑斑病的控制及貯藏品質的影響[J]. 胡培芳,李永才,馬岳岳,畢陽,張婷婷,張彥東.  果樹學報. 2018(02)
[5]采后亞硒酸鈉處理對杏果黑斑病的控制及貯藏品質的影響[J]. 高春麗,李永才,畢陽,劉筱,楊蘭,喬文景,王迪,唐瑛.  食品科學. 2016(14)
[6]植物病原真菌致病機理研究進展[J]. 高芬,褚建梅,李靜虹,王夢亮.  江蘇農業(yè)學報. 2014(05)
[7]植物病原真菌中MAPK級聯(lián)通路研究進展[J]. 彭靜靜.  江蘇農業(yè)科學. 2014(09)
[8]玉米大斑病菌MAPK超家族的全基因組鑒定及途徑模型建立[J]. 鞏校東,張曉玉,田蘭,王星懿,李坡,張盼,王玥,范永山,韓建民,谷守芹,董金皋.  中國農業(yè)科學. 2014(09)
[9]稻曲病菌UvHog1基因的克隆及表達分析[J]. 饒玉春,丁正中,陳析豐,曾大力,馬伯軍,顧志敏.  中國水稻科學. 2014(01)
[10]MAPK信號通路研究進展[J]. 陳建勇,王聰,王娟,曹禮榮.  中國醫(yī)藥科學. 2011(08)

博士論文
[1]稻瘟病菌G蛋白及MAPK信號途徑相關基因的功能分析[D]. 張海峰.南京農業(yè)大學 2011

碩士論文
[1]基于蘋果梨果皮含量水平的酚類物質對Alternaria alternata侵染及胞外降解酶的調控[D]. 劉筱.甘肅農業(yè)大學 2017
[2]發(fā)育及貯藏期蘋果梨果皮蠟質對Alternaria alternata侵染的影響[D]. 唐瑛.甘肅農業(yè)大學 2016
[3]橡膠樹白粉菌致病相關基因及Mapk途徑相關基因的克隆和定量分析[D]. 孫雅琦.海南大學 2015
[4]灰葡萄孢胞壁降解酶、角質酶及其對番茄植株的致病作用[D]. 吳潔云.揚州大學 2007



本文編號：3418893