目的構(gòu)建兩歧雙歧桿菌介導的銅綠假單胞菌外膜蛋白F-I疫苗,研究其對小鼠的保護力及免疫機制。方法以銅綠假單胞菌PA01標準株提取的基因組DNA為模板,PCR分別擴增OprF和OprI抗原基因,通過基因拼接法剪接獲取OprF-I融合基因,插入pGEX-1λT,得到pGEX-OprF-I后電穿孔至E.coli BL21（DE3）,經(jīng)IPTG誘導,用SDS-PAGE和Western blot對重組菌的表達情況進行分析和鑒定。將重組質(zhì)粒電穿孔到兩歧雙歧桿菌中,構(gòu)建重組Bb（pGEX-OprF-I）疫苗并進行雙酶切和PCR鑒定,然后分析及鑒定其誘導表達產(chǎn)物。將rBb（pGEX-OprF-I）疫苗灌胃接種小鼠,PA01株攻擊后2周殺鼠,常規(guī)ELISA檢測血清抗體,分離肺組織計數(shù)肺細菌負荷,分離脾臟制備脾細胞懸液,分別用MTT法和FCM檢測脾細胞的增殖、亞群及凋亡,PCR檢測脾細胞因子變化。結(jié)果成功擴增1050 bp的OprF基因、194 bp的OprI基因和1289 bp的重慶市科委地方病重大專項基金項目（No.2008AB5055,2008AB5008,2008AB5054）OprF-I融合基因,... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

OprF和OprI基因PCR產(chǎn)物鑒定圖譜

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文17圖2OprF,OprI及OprF-I融合基因PCR產(chǎn)物鑒定圖譜Fig.2PCRidentificationofOprFlinker,OprIlinkerandOprF-IfusiongeneM:DNAmarker;1-2:PCRproductofOprFlinker;3-4:PCRproductofOprIlinker;5-8:PCRproductofOprF-Ifusiongene2.3質(zhì)粒pGEX-OprF-I的酶切鑒定以pGEX-1λT作對照，提取質(zhì)粒pGEX-OprF-I進行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，可得到4947bp的載體片段和1289bp的OprF-I融合基因片段（圖3）。圖3質(zhì)粒pGEX-OprF-I的雙酶切鑒定Fig.3IdentificationofenzymedigestionofpGEX-OprF-IM:DNAmarker;1-2:pGEX-1λT;3-4:ProductsofpGEX-OprF-Iwithenzymedigestion2.4質(zhì)粒pGEX-OprF-I的PCR鑒定以從重組菌中提取的質(zhì)粒pGEX-OprF-I為模板，P1、P4為引物，PCR擴增出1289bp的OprF-I基因片段（圖4）。

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文17圖2OprF,OprI及OprF-I融合基因PCR產(chǎn)物鑒定圖譜Fig.2PCRidentificationofOprFlinker,OprIlinkerandOprF-IfusiongeneM:DNAmarker;1-2:PCRproductofOprFlinker;3-4:PCRproductofOprIlinker;5-8:PCRproductofOprF-Ifusiongene2.3質(zhì)粒pGEX-OprF-I的酶切鑒定以pGEX-1λT作對照，提取質(zhì)粒pGEX-OprF-I進行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，可得到4947bp的載體片段和1289bp的OprF-I融合基因片段（圖3）。圖3質(zhì)粒pGEX-OprF-I的雙酶切鑒定Fig.3IdentificationofenzymedigestionofpGEX-OprF-IM:DNAmarker;1-2:pGEX-1λT;3-4:ProductsofpGEX-OprF-Iwithenzymedigestion2.4質(zhì)粒pGEX-OprF-I的PCR鑒定以從重組菌中提取的質(zhì)粒pGEX-OprF-I為模板，P1、P4為引物，PCR擴增出1289bp的OprF-I基因片段（圖4）。

【參考文獻】：
期刊論文
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[4]銅綠假單胞菌OprF疫苗的研究進展[J]. 李文桂,陳雅棠.  熱帶醫(yī)學雜志. 2016(11)
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[8]日本血吸蟲重組質(zhì)粒pGEX-Sj32的構(gòu)建及其在大腸埃希菌BL21中的表達[J]. 譚建蓉,李文桂,張麗.  國際檢驗醫(yī)學雜志. 2014(23)
[9]重組雙歧桿菌研究進展[J]. 劉美辰,賀莉芳,周必英.  中國病原生物學雜志. 2014(05)
[10]雙歧桿菌介導的福氏志賀菌Bb-ipaB疫苗的構(gòu)建[J]. 王國富,薛士鵬,白麗,吳利先.  大理學院學報. 2013(03)



本文編號：3370663