目的構(gòu)建兩歧雙歧桿菌介導(dǎo)的銅綠假單胞菌外膜蛋白F-I疫苗,研究其對小鼠的保護力及免疫機制。方法以銅綠假單胞菌PA01標(biāo)準(zhǔn)株提取的基因組DNA為模板,PCR分別擴增OprF和OprI抗原基因,通過基因拼接法剪接獲取OprF-I融合基因,插入pGEX-1λT,得到pGEX-OprF-I后電穿孔至E.coli BL21（DE3）,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),用SDS-PAGE和Western blot對重組菌的表達(dá)情況進(jìn)行分析和鑒定。將重組質(zhì)粒電穿孔到兩歧雙歧桿菌中,構(gòu)建重組Bb（pGEX-OprF-I）疫苗并進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定,然后分析及鑒定其誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物。將rBb（pGEX-OprF-I）疫苗灌胃接種小鼠,PA01株攻擊后2周殺鼠,常規(guī)ELISA檢測血清抗體,分離肺組織計數(shù)肺細(xì)菌負(fù)荷,分離脾臟制備脾細(xì)胞懸液,分別用MTT法和FCM檢測脾細(xì)胞的增殖、亞群及凋亡,PCR檢測脾細(xì)胞因子變化。結(jié)果成功擴增1050 bp的OprF基因、194 bp的OprI基因和1289 bp的重慶市科委地方病重大專項基金項目（No.2008AB5055,2008AB5008,2008AB5054）OprF-I融合基因,... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

OprF和OprI基因PCR產(chǎn)物鑒定圖譜

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文17圖2OprF,OprI及OprF-I融合基因PCR產(chǎn)物鑒定圖譜Fig.2PCRidentificationofOprFlinker,OprIlinkerandOprF-IfusiongeneM:DNAmarker;1-2:PCRproductofOprFlinker;3-4:PCRproductofOprIlinker;5-8:PCRproductofOprF-Ifusiongene2.3質(zhì)粒pGEX-OprF-I的酶切鑒定以pGEX-1λT作對照，提取質(zhì)粒pGEX-OprF-I進(jìn)行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，可得到4947bp的載體片段和1289bp的OprF-I融合基因片段（圖3）。圖3質(zhì)粒pGEX-OprF-I的雙酶切鑒定Fig.3IdentificationofenzymedigestionofpGEX-OprF-IM:DNAmarker;1-2:pGEX-1λT;3-4:ProductsofpGEX-OprF-Iwithenzymedigestion2.4質(zhì)粒pGEX-OprF-I的PCR鑒定以從重組菌中提取的質(zhì)粒pGEX-OprF-I為模板，P1、P4為引物，PCR擴增出1289bp的OprF-I基因片段（圖4）。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文17圖2OprF,OprI及OprF-I融合基因PCR產(chǎn)物鑒定圖譜Fig.2PCRidentificationofOprFlinker,OprIlinkerandOprF-IfusiongeneM:DNAmarker;1-2:PCRproductofOprFlinker;3-4:PCRproductofOprIlinker;5-8:PCRproductofOprF-Ifusiongene2.3質(zhì)粒pGEX-OprF-I的酶切鑒定以pGEX-1λT作對照，提取質(zhì)粒pGEX-OprF-I進(jìn)行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，可得到4947bp的載體片段和1289bp的OprF-I融合基因片段（圖3）。圖3質(zhì)粒pGEX-OprF-I的雙酶切鑒定Fig.3IdentificationofenzymedigestionofpGEX-OprF-IM:DNAmarker;1-2:pGEX-1λT;3-4:ProductsofpGEX-OprF-Iwithenzymedigestion2.4質(zhì)粒pGEX-OprF-I的PCR鑒定以從重組菌中提取的質(zhì)粒pGEX-OprF-I為模板，P1、P4為引物，PCR擴增出1289bp的OprF-I基因片段（圖4）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3370663